Journal Club: Validierung einer cIEF zur Identifikation monoklonaler Antikörper
Einführung und Hintergrund
Monoklonale Antikörper (monoclonal antibodies, mABs) sind monovalente Immunglobulin-Moleküle, die nur an ein spezifisches Epitop binden. Diese Antikörper finden eine breite Anwendung in der Diagnostik, Analytik und als Arzneimittel bei der Behandlung von Krebs und Autoimmunerkrankungen. Der aufstrebende Markt von mAB-Biosimilars erfordert eine korrekte Charakterisierung nach vorheriger Isolierung dieser Moleküle. Die Isolierung dieser Antikörper ist jedoch eine große Herausforderung und wurde erstmals von Georges Köhler und César Milstein durchgeführt, für die sie 1984 den Nobelpreis für Medizin und Physiologie erhielten.
Eine der größten Herausforderungen bei der Charakterisierung von mABs ist ihre Möglichkeit für posttranslationale Modifikationen. Unter Stressbedingungen verändern diese Moleküle häufig ihr Ladungsprofil und entsprechend könnte ihre Aktivität beeinflusst sein (z.B. aufgrund eines Verlusts an Glykosylierungen). Ein kritischer Aspekt der mAB-Biosimilar-Entwicklung besteht darin, solche Änderungen des Ladungsprofils zu überwachen, da sie direkt mit der Sicherheit, Wirksamkeit und möglichen Spezifität des Moleküls zusammenhängen. Eine Methode zur Bestimmung unterschiedlich geladener Moleküle ist die isoelektrische Fokussierung. Eine Charakterisierung von Antikörpern kann durch LC-MS (Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Massenspektroskopie) oder mit einigen im Handel erhältlichen Kits durchgeführt werden, aber diese Verfahren sind entweder teuer oder erfordern hochentwickelte Instrumente und sind als QC-Laborroutinemethoden zur Arzneimittelfreigabe schwierig zu implementieren. In diesem Artikel diskutieren wir die Validierung einer Kapillar-Isoelektrischen-Fokussierungsmethode (capillary isoelectric focussing, cIEF), die für die Identifikation (ID) von Ladungsvarianten monoklonaler Antikörper auf Grundlage ihrer isoelektrischen Punkte (pI; zwischen 7,4 - 8,0) eingesetzt werden kann.
Methodenentwicklung und -optimierung
Das Grundprinzip einer cIEF-Methode ist die Trennung der Proteine nach ihren pIs in einem pH-Gradienten, der durch amphotere Elektrolyte in einer beschichteten oder unbeschichteten Silica-Kapillare gebildet wird. Man kann es sich als eine Art Zonenelektrophorese vorstellen.
Die Methode wurde von Suba et al. mit dem Ziel entwickelt, die höchste Auflösung in kürzester Zeit zu erreichen. Dabei wurden 5 Isoformen eines im Handel erhältlichen menschlichen IgG1-Antikörpers als Standard zur Optimierung von zwei wichtigen Faktoren verwendet:
- Fokussierungs- und Mobilisierungsspannung
- Salz- und Harnstoffgehalt in der Probe.
Die Wahl des Träger-Ampholyten ist ein kritischer Punkt in der Entwicklung von cIEF-Methoden. Um das optimale Verhältnis der Ampholyten zu ermitteln, wurden sowohl pH 3-10 als auch pH 5-8 einzeln jeweils in einer Konzentration von 3% v/v getestet. Das Ergebnis zeigte entweder eine schlechte Auflösung oder ein Peak-Splicing. Schließlich wurde eine Mischung von pH 3-10 und pH 5-8 im Verhältnis 4:2 basierend auf den Ergebnissen der Auftragung der Migrationszeit gegen den isoelektrischen Punkt ausgewählt. Als Cut-Off für die Regressionsgerade des Diagramms wurde ein Bestimmtheitsmaß R2 > 0,99 definiert, entsprechend wurden alle Läufe unter 0,99 nicht berücksichtigt.
Für die Fokussierung wurden drei Spannungen von 20 kV, 25 kV und 30 kV getestet und für die weiteren Versuche wurde eine Spannung von 30 kV aufgrund des besten pH-Gradienten ausgewählt. Im Falle der Mobilisierung zeigten alle drei Spannungen ähnliche Profile und es konnte jeweils ein pH-Gradient etabliert werden. Bei 30 kV war die beobachtete Migrationszeit jedoch die kürzeste und wurde daher für die finale Methode ausgewählt.
Für die Bestimmung der optimalen Salzkonzentration führten 25 mM Tris zu einem guten pH-Gradienten, verursachten jedoch Peak-Splicing und zeigten eine schlechte Auflösung unter den Peaks. Ein ähnliches Muster wurde in Gegenwart von Harnstoff beobachtet. Die Zugabe von 4 M Harnstoff erzeugte einen guten pH-Gradienten, verursachte jedoch eine verzögerte Migration der Peaks. Daher wurde ein salz- und harnstofffreies System als das beste Verfahren angesehen.
Die genaue pI-Bestimmung hängt von der Qualität der pI-Marker ab. Daher wurden synthetische Marker basierend auf einem breiten pI-Bereich, einem guten Absorptionsprofil und einer minimalen Wechselwirkung mit den Kapillarwänden ausgewählt. Für die Entwicklung wurden 3 Marker mit pIs von 7,0, 8,4 und 9,0 ausgewählt. Da bekannt ist, dass die Ladung des Analyten zwischen 7,4 und 8,0 liegt, erzeugen die ausgewählten Marker einen guten pH-Gradienten. Daher wurde ihr R2-Wert, der durch Auftragung der Funktion aus Migrationszeit und isoelektrischem Punkt erhalten wurde, für den Systemeignungstest (SST) verwendet.
Analytische Methodenvalidierung und Diskussion
Im Rahmen der analytischen Validierung wurde die Methode auf Spezifität und interne Laborpräzision getestet. Für die interne Laborpräzision wurde die Methode hinsichtlich der Präzision unter Anwendung unterschiedlicher Geräte, unterschiedlicher Tage und unterschiedlicher Analysten untersucht. Insgesamt zwei Analytiker führten den Test an zwei verschiedenen Instrumenten über einen Zeitraum von drei Tagen mit jeweils 6 Probenpräparaten pro Tag durch. Die Ergebnisse für insgesamt 18 Proben wurden analysiert. Von diesen wurde der mittlere pI-Wert von jedem der 5 Peaks berechnet und die relative Standardabweichung (RSD) wurde bestimmt. Für alle Peaks betrug die RSD weniger als 0,2%. Die höchste Standardabweichung betrug 0,013, was niedriger als der minimale Abstand (ΔpI = 0,088) zwischen den Peaks ist. Dies entspricht der Definition der Autoren, dass für ID-Tests "die Akzeptanzkriterien für Standardabweichungen der isoelektrischen Punkte der einzelnen Peaks niedriger sein sollten als die Abstände zwischen den Probenpeaks (ΔpI)". Darüber hinaus wurde eine relative Standardabweichung von 4,0 % für die Variabilität der Migrationszeiten der verwendeten Standard-pI-Marker beobachtet.
Zur Spezifität wurden insgesamt vier verschiedene kommerziell erhältliche mABs im Bereich von pI 7,0 - 9,0 getestet. Die mABs wurden einer C-terminalen Lysin-Spaltung durch Carboxypeptidase B unterzogen, und die erhaltenen Varianten wurden untersucht. Spezifische Änderungen konnten detektiert werden.
Die Robustheit der Methode wurde weiter getestet, indem verschiedene Chargen Fluor-Kohlenstoff beschichteter Kapillaren sowie andere Kapillaren mit Innenbeschichtungen aus Polyvinylalkohol (PVA) und Polyacrylamid (PAAM) verwendet wurden. Die Kapillaren wurden von verschiedenen Lieferanten bezogen. Es wurden keine wesentlichen Unterschiede in den Ergebnissen beobachtet. In ähnlicher Weise zeigten Tests mit verschiedenen Chargen von Reagenzien und Puffern keine signifikanten Unterschiede in den erhaltenen Ergebnissen.
Zusammenfassend ist die vorgeschlagene Methode eine schnelle und bequeme Methode, die routinemäßig für isoelektrische Fokussierungen monoklonaler Antikörper eingesetzt werden kann. Diese Methode kann jedoch nur die geladenen Varianten in dem begrenzten Bereich von pI 7,0 und 9,0 identifizieren. Die Auswahl der Ampholyten und die Bestimmung der Salz- und Harnstoffkonzentrationen sind das Bottleneck bei der Entwicklung dieser Methode gewesen. Nur mit der richtigen Ampholyt-, Salz- und Harnstoff-Konzentration kann eine gute Peakform und -auflösung erhalten werden. Gemäß der ICH (Q2)R1-Richtlinie, die für die Methodenvalidierung verwendet wird, ist es für Identifikationsmethoden ausreichend, Untersuchungen zur Spezifität durchführen. Die hier zusätzliche Evaluierung der Präzision ist gemäß den Validierungsanforderungen dieser Richtlinie nicht erforderlich. Obwohl es das Gesamtergebnis des Artikels nicht ändert, erlauben die Präzisionsergebnisse ein wenig mehr Informationen über die Methode und haben sich als sehr gut herausgestellt. Somit ist das Verfahren zur Identifikation von monoklonalen Antikörpern und deren Ladungsvarianten geeignet, da es eine akzeptable Spezifität und Präzision aufweist.