Was versteht man unter der Nachweis- und Bestimmungsgrenze?
In unserem Blog möchten wir heute zwischen den Begriffen Nachweisgrenze (limit of detection, LOD) und Bestimmungsgrenze (limit of quantification, LOQ) unterscheiden. Beides sind Begriffe, die für die analytische Methodenvalidierung relevant sind.
Nachweisgrenze (LOD)
Die Nachweisgrenze LOD ist die niedrigstmögliche Konzentration, bei der die Methode den Analyten innerhalb der Matrix mit einem gewissen Vertrauensgrad nachweisen (aber nicht mehr quantifizieren) kann. Sie ist auch definiert als die niedrigste Konzentration, die sich mit gewisser Zuverlässigkeit vom Hintergrundrauschen abhebt. Üblicherweise wird die Nachweisgrenze nur bei qualitativen Bestimmungen von Verunreinigungen / Grenzprüfungen ermittelt, kann aber manchmal auch bei quantitativen Bestimmungen erforderlich sein. Abhängig davon, ob die Methode instrumenteller oder nicht-instrumenteller Art ist, werden unterschiedliche Empfehlungen von ICH Q2(R1) Methodenvalidierungsrichtlinie gegeben. Die Evaluierung der LOD kann auf 3 verschiedene Arten erfolgen:
1. Visuelle Prüfung:
Diese Art der Evaluierung wird meistens bei nicht-instrumentellen Methodenangewandt. Ein Beispiel könnte der Nachweis der Mindestkonzentration eines Antibiotikums sein, das zur Hemmung eines Bakterienwachstums erforderlich ist. Dieser Nachweis wird mit sogenannten Antibiotika-Scheiben und mit anschließender Berechnung des Hemmhofs durchgeführt.
2. Bestimmung des Signal-Rausch-Verhältnisses (S/N):
Dieses Detektionsverfahren kann nur für Verfahren angewendet werden, die ein Basislinienrauschen zeigen, z.B. HPLC-Methoden. Es ist eine Technik, bei der die Signale der Proben, die den Analyten in geringen Konzentrationen enthalten, mit dem Signal einer Blindprobe verglichen werden. Dabei wird die kleinste Konzentration bestimmt, bei der das Signal des Analyten noch zuverlässig nachgewiesen werden kann. Ein allgemein akzeptables Signal-Rausch-Verhältnis für die Schätzung der Nachweisgrenze ist üblicherweise 3:1 (oder - etwas veraltet - 2:1).
3. Mit Hilfe der Standardabweichung (SD) und Steigung:
Diese Evaluierungsmethode ist auch für instrumentelle Methoden geeignet. Für die Durchführung gibt es zwei Möglichkeiten:
a. Evaluierung basierend auf der SD des Blanks: Dies beinhaltet die Messung einer bestimmten Anzahl an Blindproben und die anschließende Berechnung der SD aus den erhaltenen Werten.
b. Evaluierung basierend auf der Kalibrierungskurve: Unter Verwendung von Proben, die den Analyten im Bereich der LOD enthalten, wird (mind.) eine Kalibrierungskurve generiert. Von der ICH Q2(R1) wird dann vorgeschlagen, als Standardabweichung zum Einsetzten in unten angegebene Formel die Standardabweichung der y-Abschnitte der Regressionsgeraden zu verwenden (dies impliziert, dass mehrere Kalibrierkurven generiert wurden) oder die Reststandardabweichung der Regressionsgeraden zu verwenden. Da wir diesem Ansatz bislang in allen Validierungen unser Kundenprojekte noch nicht begegnet sind, hat dies zu einer internen Diskussion geführt, was damit gemeint sein könnte. So können wir uns vorstellen, dass innerhalb einer Regressionsgerade eine SD berechnet werden kann, wenn alle Ergebnisse z.B. auf 100% normiert würden, sind uns aber nicht sicher, ob das von der ICH gemeint ist. Wir sind dieser Frage nachgegangen und haben in einem neuen Post darüber berichtet.
Unabhängig von der Evaluierungstechnik wird die LOD folgendermaßen berechnet:
LOD = 3,3 * σ / S
wobei σ = die SD der erhaltenen Ergebnisse und S = die Steigung der Kalibrierkurve ist.
Und was statistisch hinter dem Faktor von „3,3“ steckt, erfahren Sie in diesem Artikel.
Bestimmungsgrenze (LOQ)
Die Bestimmungsgrenze LOQ (oder manchmal auch: „Quantifizierungsgrenze“) ist die niedrigstmögliche Konzentration eines Analyten, die durch eine Methode noch zuverlässig quantifiziert werden kann. Zuverlässig bedeutet in diesem Zusammenhang, dass eine angemessene Präzision und Richtigkeit vorhanden sein und nachgewiesen werden muss. Die Ermittlung der Bestimmungsgrenze ist für quantitative Bestimmungen von Verunreinigungen bzw. Abbauprodukten gefordert. Ähnlich wie bei LOD kann LOQ auch auf unterschiedliche Arten bestimmt werden, ebenfalls abhängig davon, ob die Methode instrumenteller oder nicht-instrumenteller Art ist.
1. Visuelle Prüfung:
Der Nachweis erfolgt durch die Analyse von Proben mit bekannten Konzentrationen des Analyten und das Schätzen eines Minimalwertes, bei dem die Konzentration quantifiziert werden kann. Ein gutes Beispiel für eine visuelle Untersuchung der LOQ ist die Titration zweier chemischer Substanzen. Eine bekannte Konzentration des Analyten wird zugefügt und es kommt zum Farbumschlag.
2. Bestimmung des Signal-Rausch-Verhältnisses (S/N):
Wie für die LOD erläutert, kann die LOQ auch unter Verwendung eines Signal-zu-Rausch-Ansatzes bestimmt werden, bei dem die Signale bekannter Konzentrationen des Analyten mit denen der Blindprobe verglichen werden und die kleinste Konzentration festgelegt wird, bei der der Analyt mit entsprechender Sicherheit noch gut quantifiziert werden kann. Als Richtwert wird dabei ein S/N-Verhältnis von 10:1 angesehen. Beispiele sind chromatographische Methoden.
3. Mit Hilfe der Standardabweichung (SD) und Steigung:
Wie bei der LOD gibt es auch hier zwei Möglichkeiten, die SD und die Steigung für die LOQ-Berechnung zu verwenden:
a. Evaluierung basierend auf dem SD des Blanks: Wie bei LOD. Messen Sie mehrere Blindproben (Blanks) und berechnen Sie die SD aus den erhaltenen Ergebnissen.
b. Evaluierung basierend auf der Kalibrierungskurve: Unter Verwendung von Proben, die den Analyten im Bereich der LOQ enthalten, muss (mind.) eine Kalibrierungskurve generiert und untersucht werden. Die Auswertemöglichkeiten sind die gleichen wie bei der LOD, mit der gleichen mittlerweile geklärten Frage.
Die LOQ wird wie folgt berechnet:
LOQ = 10 * σ / S
wobei σ = die SD der erhaltenen Ergebnisse und S = die Steigung der Kalibrierkurve ist.
Anwendungsbeispiele für diesen Evaluierungsansatz können z.B. photometrische Gehaltsbestimmungen von Verunreinigungen oder ELISAs sein.
Zusammenfassend ist sowohl die Bestimmung der Nachweisgrenze LOD als auch der Bestimmungsgrenze LOQ wichtig, da sie beide Aussagen zur Fähigkeit der Methode treffen, sehr geringe Konzentrationen des Analyten zu ermitteln (noch konkret zu bestimmen = LOQ bzw. lediglich nachweisen zu können = LOD). Insbesondere bei Verfahren zum Nachweis von sehr geringen Mengen an Verunreinigungen (also entsprechenden Reinheitstests) sind diese beiden Werte sehr nützlich. Für Wirksamkeits- oder Gehaltsbestimmungen (assays) sind sie von der ICH Q2(R1) nicht vorgeschrieben, was auch absolut Sinn macht, da diese Bestimmungen üblicherweise bei 100% Testkonzentration erfolgen. Die Evaluierungstechniken für die Nachweis- und Bestimmungsgrenze sind sehr ähnlich, mit Ausnahme der akzeptierten Werte für die S/N-Ansätze und der konstanten Werte, für die Ansätze mit SD und Steigung (3,3 für LOD und 10 für LOQ). Der Grund dafür ist logisch: Die Gewissheit, den Ergebnissen vertrauen zu können, muss höher sein, wenn die Ergebnisse noch verlässlich quantifiziert (LOQ) anstatt nur erkannt (LOD) werden wollen. Von den veralteten, aus dem klinischen Bereich stammenden Begriffen von analytischer und funktioneller Sensitivität ist Abstand zu nehmen.