Blogbeiträge

Verifizierung einer Arzneibuchmethode am Beispiel des LAL-Tests

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Für die Freigabe von Arzneimitteln ist nicht nur entscheidend, dass der Wirkstoff in angegebener Konzentration und Wirksamkeit vorhanden ist, sondern auch, dass das Arzneimittel möglichst wenig Verunreinigungen aufweist. Bei sterilen, z.B. parenteral verabreichten Arzneimitteln sollten nicht nur keine Keime mehr im Produkt vorhanden sein, sondern auch keine bakteriellen „Rückstände“. Darunter sind z.B. fieberauslösende Bestandteile der Zellmembran zu verstehen, sogenannte Endotoxine. Diese können mit verschiedenen Methoden nachgewiesen werden, eine davon ist der Limulus-Amöbozyten-Lysat (LAL) Test.

Die Durchführung dieses Tests ist in den Arzneibüchern beschrieben (Ph. Eur. 2.6.14 und USP <85>) und kann auf verschiedene Weise erfolgen, z.B. als quantitativer photometrischer Test oder als Limit-Test per Gel-Clot Technik. Bei einem quantitativen Test wird ein konkretes Ergebnis mit einem Zahlenwert erhalten, bei einem Limit-Test kann nur die Aussage getroffen werden, ob Endotoxine in einer Konzentration oberhalb eines Grenzwerts in der Probe vorhanden sind oder nicht.

Wie bestimme ich die LOD mit Hilfe der Kalibrierfunktion?

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Im Rahmen von Methodenvalidierungen ist es bei Reinheitstests erforderlich, die Nachweisgrenze (Limit of detection, LOD; oder auch DL = detection limit) bzw. die Bestimmungsgrenze (Limit of quantification, LOQ) zu ermitteln. Dies kann z.B. unter Anwendung der Kalibriergeraden erfolgen und wird dann in der Literatur als „Kalibriergeradenverfahren“ bezeichnet.

Am Beispiel der Nachweisgrenze werden dafür von der Validierungsguideline ICH Q2(R1) in Abschnitt 6.3 bzw. 6.3.2 folgende Vorgaben gemacht:

Warum wird beim Bakterienrückhaltetest ein Maximaldruck von 30 psi vorgegeben?

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Filtervalidierung

Kürzlich bin ich mit der Frage konfrontiert worden, ob ich wisse, warum beim Bakterienrückhaltetest gemäß ASTM F838 ein Maximaldruck von 30 psi (= 2,07 bar) vorgegeben sei. Dürfte der nicht überschritten werden, weil dann keine Bakterienrückhaltung des Filters mehr gegeben sei? Diese Frage ist klar zu verneinen, Filtermembranen sind auch bei deutlich höheren Drücken noch bakterienzurückhaltend. So weisen beispielsweise Millipore Durapore PVDF 0,22 µm Membranen einen wasserbenetzten Bubble Point von 3,45 bar auf, der mit der Bakterienrückhaltung korreliert (siehe dazu auch unser Blogartikel „Wie hängen Bakterienrückhaltung und Filterintegrität zusammen?“). Das kann also nicht der Grund sein.

Ausreißer bei Methodenvalidierung und Transfer

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Zwei Beispiele

Beginnen wir mit einem Beispiel. Während der Validierung einer analytischen Methode soll die Linearität evaluiert werden. Dazu werden 5 Konzentrationen mit je 3 Replikaten untersucht (um neben der Linearität auch die Genauigkeit in einem Ansatz zu erschlagen). Bei der Konzentration, die 120% der Testkonzentration entspricht, ist ein Wert deutlich höher als die beiden anderen. Dennoch kann auch unter Berücksichtigung dieses Wertes das Akzeptanzkriterium eingehalten werden. Jetzt stellt sich die Frage, was man tun soll. Muss man die gesamte 120%-Konzentration mit allen 3 Replikaten wiederholen, kann man den auffälligen ausschließen und nur den Mittelwert aus den beiden anderen bilden oder muss man gar alle Experimente zur Linearität wiederholen?

Modifizierte Bakterienrückhaltetests - was tun bei bakterizider Produktlösung?

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Filtervalidierung

Bei Pharma-Unternehmen, deren Produktherstellung unter aseptischen Bedingungen erfolgt, gehört die Sterilfiltration im letzten Schritt vor der Abfüllung einfach dazu. Die Validierung des Herstellprozesses umfasst dabei auch den Schritt der Sterilfiltration. Entsprechend muss im Rahmen der Filtervalidierung nachgewiesen werden, dass der Filter in der Lage ist, Bakterien zurück zu halten und damit die Keimfreiheit des Produkts zu gewährleisten. Dieser Nachweis wird mit einem Bakterienrückhaltetest oder auch bakteriellem Belastungstest gemäß ASTM F838-15a erbracht. Bevor dieser Bakterienrückhaltetest jedoch durchgeführt werden kann, muss zuvor mit einem Viabilitätstest geprüft werden, dass die zu testende Produktlösung keinen negativen Effekt auf das im Bakterienrückhaltetest eingesetzte Bakterium hat. Das hört sich kompliziert an? Das soll es nicht – stellen Sie sich einfach vor, was wäre, wenn Ihre Produktlösung das Testbakterium töten würde… Dann wüssten Sie im Bakterienrückhaltetest nicht, ob Sie ein steriles Filtrat erhalten, weil der Filter seinen Job gut gemacht hat oder ob Ihre Produktlösung die Bakterien getötet hat.

Was bedeuten eigentlich „dilution integrity“, „dilution linearity“ und „parallelism“?

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Eine Anfrage über unsere Homepage hat mich dazu veranlasst, mich einmal intensiver mit den Begriffen „dilution integrity“, „dilution linearity“ und „parallelism“ zu beschäftigen. Sie alle entstammen dem Bereich der Validierung bioanalytischer Methoden, also solcher, bei denen eine biologische Probe wie beispielsweise menschliches oder tierisches Blut oder Urin untersucht wird. Solche Analysen sind im Rahmen präklinischer und klinischer Studien bei der Entwicklung von Arzneimitteln notwendig. Die dafür anzuwendenden Analysemethoden wie z.B. LC- oder GC-MS oder Ligandenbindungsassays (LBA) sind natürlich vor ihrem Einsatz zu validieren. Im Gegensatz zur Validierung analytischer Methoden für bereits zugelassene Arzneimittel existiert derzeit keine harmonisierte Richtlinie bezüglich der Anforderungen für die Validierung bioanalytischer Methoden. So haben die unterschiedlichen Behörden ihre eigenen Richtlinien herausgegeben, siehe auch unseren Blogartikel dazu. Entsprechend kann es leicht zu Verwirrungen kommen. In diesem Blogartikel möchten wir die 3 Begriffe genauer erklären und gegeneinander abgrenzen.

Wie hängen Bakterienrückhaltung und Filterintegrität zusammen?

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Filtervalidierung

Bei der pharmazeutischen Produktion, insbesondere der aseptischen Herstellung von Parenteralia, werden Sterilfilter eingesetzt. Im Rahmen der Filtervalidierung muss der Nachweis erbracht werden, dass der zur Sterilfiltration eingesetzte Filter in der Lage ist, Bakterien und potentielle unerwünschte Bestandteile wie Partikel oder Fasern zurückzuhalten und damit die Sterilität des Produktes zu gewährleisten. Die entsprechende Prüfung erfolgt als Bakterienrückhaltetest (Bacterial Challenge Test, "Bakterielle Belastungsprüfung") gemäß ASTM F838-15a. Dabei wird der Filter mit einer definierten Anzahl an besonders kleinen Bakterien (Brevundimonas diminuta) in Lösung angeströmt und das Filtrat anschließend auf Bakterienwachstum untersucht. Ein steriles Filtrat zeigt, dass der Filter in der Lage ist > 107 KBE/cm2 Filterfläche zurückzuhalten und damit für seinen Einsatzzweck geeignet ist.

Revision der Validierungsrichtline ICH Q2(R1) geplant

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Wie im Sommer dieses Jahres und jetzt im November etwas detaillierter bekannt wurde, wird die von der ICH herausgegebene Richtlinie zur Validierung analytischer Methoden überarbeitet werden. Die Inhalte der im November 2005 zusammengefassten Richtlinie entstammen zwei zuvor separaten Richtlinien, die vor mehr als 20 Jahren veröffentlicht wurden. Der Beschluss zur Revision der Validierungsguideline ICH Q2(R1) ist im Juni beim ICH-Meeting getroffen worden zusammen mit der Entscheidung der Erstellung einer neuen Richtlinie zur Methodenentwicklung (ICH Q14). Noch ist unklar, ob dies zwei eigenständige Dokumente sein werden, oder ob eine kombinierte Richtlinie resultieren wird, da eine mögliche Kombination durch das Expertenkomitee geprüft werden soll.

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