Methodenvalidierung

Verifizierung einer Arzneibuchmethode am Beispiel des LAL-Tests

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Für die Freigabe von Arzneimitteln ist nicht nur entscheidend, dass der Wirkstoff in angegebener Konzentration und Wirksamkeit vorhanden ist, sondern auch, dass das Arzneimittel möglichst wenig Verunreinigungen aufweist. Bei sterilen, z.B. parenteral verabreichten Arzneimitteln sollten nicht nur keine Keime mehr im Produkt vorhanden sein, sondern auch keine bakteriellen „Rückstände“. Darunter sind z.B. fieberauslösende Bestandteile der Zellmembran zu verstehen, sogenannte Endotoxine. Diese können mit verschiedenen Methoden nachgewiesen werden, eine davon ist der Limulus-Amöbozyten-Lysat (LAL) Test.

Die Durchführung dieses Tests ist in den Arzneibüchern beschrieben (Ph. Eur. 2.6.14 und USP <85>) und kann auf verschiedene Weise erfolgen, z.B. als quantitativer photometrischer Test oder als Limit-Test per Gel-Clot Technik. Bei einem quantitativen Test wird ein konkretes Ergebnis mit einem Zahlenwert erhalten, bei einem Limit-Test kann nur die Aussage getroffen werden, ob Endotoxine in einer Konzentration oberhalb eines Grenzwerts in der Probe vorhanden sind oder nicht.

Wie bestimme ich die LOD mit Hilfe der Kalibrierfunktion?

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Im Rahmen von Methodenvalidierungen ist es bei Reinheitstests erforderlich, die Nachweisgrenze (Limit of detection, LOD; oder auch DL = detection limit) bzw. die Bestimmungsgrenze (Limit of quantification, LOQ) zu ermitteln. Dies kann z.B. unter Anwendung der Kalibriergeraden erfolgen und wird dann in der Literatur als „Kalibriergeradenverfahren“ bezeichnet.

Am Beispiel der Nachweisgrenze werden dafür von der Validierungsguideline ICH Q2(R1) in Abschnitt 6.3 bzw. 6.3.2 folgende Vorgaben gemacht:

Ausreißer bei Methodenvalidierung und Transfer

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Zwei Beispiele

Beginnen wir mit einem Beispiel. Während der Validierung einer analytischen Methode soll die Linearität evaluiert werden. Dazu werden 5 Konzentrationen mit je 3 Replikaten untersucht (um neben der Linearität auch die Genauigkeit in einem Ansatz zu erschlagen). Bei der Konzentration, die 120% der Testkonzentration entspricht, ist ein Wert deutlich höher als die beiden anderen. Dennoch kann auch unter Berücksichtigung dieses Wertes das Akzeptanzkriterium eingehalten werden. Jetzt stellt sich die Frage, was man tun soll. Muss man die gesamte 120%-Konzentration mit allen 3 Replikaten wiederholen, kann man den auffälligen ausschließen und nur den Mittelwert aus den beiden anderen bilden oder muss man gar alle Experimente zur Linearität wiederholen?

Was bedeuten eigentlich „dilution integrity“, „dilution linearity“ und „parallelism“?

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Eine Anfrage über unsere Homepage hat mich dazu veranlasst, mich einmal intensiver mit den Begriffen „dilution integrity“, „dilution linearity“ und „parallelism“ zu beschäftigen. Sie alle entstammen dem Bereich der Validierung bioanalytischer Methoden, also solcher, bei denen eine biologische Probe wie beispielsweise menschliches oder tierisches Blut oder Urin untersucht wird. Solche Analysen sind im Rahmen präklinischer und klinischer Studien bei der Entwicklung von Arzneimitteln notwendig. Die dafür anzuwendenden Analysemethoden wie z.B. LC- oder GC-MS oder Ligandenbindungsassays (LBA) sind natürlich vor ihrem Einsatz zu validieren. Im Gegensatz zur Validierung analytischer Methoden für bereits zugelassene Arzneimittel existiert derzeit keine harmonisierte Richtlinie bezüglich der Anforderungen für die Validierung bioanalytischer Methoden. So haben die unterschiedlichen Behörden ihre eigenen Richtlinien herausgegeben, siehe auch unseren Blogartikel dazu. Entsprechend kann es leicht zu Verwirrungen kommen. In diesem Blogartikel möchten wir die 3 Begriffe genauer erklären und gegeneinander abgrenzen.

Revision der Validierungsrichtline ICH Q2(R1) geplant

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Wie im Sommer dieses Jahres und jetzt im November etwas detaillierter bekannt wurde, wird die von der ICH herausgegebene Richtlinie zur Validierung analytischer Methoden überarbeitet werden. Die Inhalte der im November 2005 zusammengefassten Richtlinie entstammen zwei zuvor separaten Richtlinien, die vor mehr als 20 Jahren veröffentlicht wurden. Der Beschluss zur Revision der Validierungsguideline ICH Q2(R1) ist im Juni beim ICH-Meeting getroffen worden zusammen mit der Entscheidung der Erstellung einer neuen Richtlinie zur Methodenentwicklung (ICH Q14). Noch ist unklar, ob dies zwei eigenständige Dokumente sein werden, oder ob eine kombinierte Richtlinie resultieren wird, da eine mögliche Kombination durch das Expertenkomitee geprüft werden soll.

Ableitung der Genauigkeit aus der Linearität – Weg 2: Wiederfindung

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Nachdem wir im letzten Blogbeitrag den ersten Lösungsweg (--> Normalisierung) für die Ermittlung der Genauigkeit bei Methodenvalidierungen, bei denen es keine Unreinheiten zum Spiken oder Alternativmethoden gibt, betrachtet haben, wollen wir uns heute den zweiten Lösungsweg ansehen.

Wir bleiben bei unserem Beispiel vom letzten Mal, wo eine SE-HPLC zur Bestimmung der Reinheit eingesetzt werden soll. Die Verunreinigungen werden als Summe der Nebenpeaks angegeben, während es sich bei dem Hauptpeak um unser gewünschtes Produkt handelt. Unser grundsätzlicher Ansatz besteht wie letztes Mal darin, die Genauigkeit aus der Linearität abzuleiten, da dies bei gegebener Spezifität (dies setzten wir wieder voraus) und Präzision entsprechend der Validierungsrichtlinie ICH Q2(R1) erlaubt ist.

Ableitung der Genauigkeit aus der Linearität – Weg 1: Normalisierung

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Im heutigen Blogbeitrag wollen wir uns einem durchaus öfter auftretenden Problem bei Methodenvalidierungen annehmen und an einem praktischen Beispiel aufzeigen, welche Lösungsmöglichkeiten es gibt.

Validiert werden soll eine SE-HPLC Methode, die zur Reinheitsbestimmung eines Arzneimittels eingesetzt werden soll. Es ist bekannt, dass Verunreinigungen (dabei handelt es sich z.B. um Aggregate und / oder Bruchstücke des Produktes) zu einem geringen Prozentsatz auftreten können.

Im Chromatogramm gibt es einen Hauptpeak, der dem intakten Produkt entspricht und ein paar kleinere Nebenpeaks, die den Verunreinigungen entsprechen und als Summe zusammengefasst werden. Betrachten wollen wir jetzt den Validierungsparameter „Genauigkeit“ (accuracy). Leider kann man weder die Verunreinigungen separat erhalten und zum Spiken einsetzen noch steht eine alternative unabhängige Bestimmungsmethode zur Verfügung. In diesem Fall erlaubt die Validierungsrichtlinie ICH Q2(R1) dann eine dritte Möglichkeit zur Bestimmung der Genauigkeit: „Accuracy may be inferred once precision, linearity and specificity have been established“ (4.1.1 c / 4.1.2 c).

Journal Club: RP-UHPLC-MS versus Peptide-Mapping zur Antikörpercharakterisierung

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Einleitung und Hintergrund

Monoklonale Antikörper (monoclonal antibodies, mABs) sind Immunglobuline, die an das gleiche Epitop binden und eine Vielzahl von Anwendungen in der Medizin und im Gesundheitswesen (u.a. als Arzneimittel) haben. Obwohl therapeutische mABs aufgrund ihrer Spezifität äußerst gefragt sind, sind sie aufgrund ihres Herstellungsprozesses heterogen und stellen damit eine Herausforderung hinsichtlich ihrer Charakterisierung dar. Während der Expression, der Aufreinigung und der späteren Lagerung können enzymatische und chemische Modifikationen wie z.B. Oxidationen oder Glykosylierungen stattfinden. Veränderungen in diesen Modifikationen können die Sicherheit und Wirksamkeit der Antikörper beeinträchtigen. Falls diese Modifikationen als kritische Qualitätsmerkmale (critical quality attributes, CQAs) eingestuft werden, so ist eine vollständige Charakterisierung regulatorisch vorgeschrieben. Zu ihrer Evaluierung können Stress-Studien angewendet werden.

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