Prüfung auf Sterilität: Hintergründe, Durchführung und Verifizierung (Eignungsprüfung)

Geschrieben von Dr. Janet Thode Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Im heutigen Blogbeitrag wollen wir uns mit der Prüfung auf Sterilität bzw. ihrer Verifizierung beschäftigen. Da es eine Arzneibuchmethode ist, sollte man in diesem Zusammenhang von Verifizierung anstelle von Validierung sprechen, auch wenn leider noch oft von Validierung dieser Methode zu lesen ist. Um beim Wording zu bleiben, in den Arzneibüchern wird dies als method suitability test (MST) bezeichnet, drückt also aus, dass es dabei um eine Eignungsprüfung der Methode handelt, was es meines Erachtens sehr gut trifft 😉

 

Was ist Sterilität?

Einfach gesagt: die „Abwesenheit lebensfähiger Mikroorganismen“.

 

Wo werden Steriltests gemacht?

Die Prüfung auf Sterilität findet bei allen Arzneimitteln Anwendung, bei denen sie gemäß den Arzneibüchern vorgeschrieben ist, wie z.B. bei Parenteralia, Augentropfen, Immunsera, Impfstoffen oder Nahtmaterialien. Entsprechend führen die mikrobiologischen Labore der Qualitätskontrolle des Arzneimittelherstellers oder beauftragte Lohnlabore diese Prüfung im Rahmen der Freigabeanalytik der produzierten Chargen durch.

Arzneimittel werden jedoch nicht nur in der Industrie hergestellt. So können beispielsweise sogenannte Schmerzpumpen von Krankenhausapotheken hergestellt werden, indem die Apotheke sterilisierte Pumpen unter aseptischen Bedingungen mit der entsprechenden Schmerzmittelinfusion befüllt. Auch eine Charge solcher in der Apotheke hergestellter Schmerzpumpen muss vor ihrer Verwendung auf Sterilität geprüft werden.

 

Warum ist eine solche Prüfung wichtig?

Ohne eine Prüfung auf Sterilität kann nicht nachgewiesen werden, dass das hergestellte Produkt (sei es jetzt eine industriell gefertigte Infusionslösung oder eine in einer Krankenhausapotheke hergestellte Schmerzpumpe) frei von potenziell gesundheitsgefährdenden Keimen ist, womit es ein mögliches Gesundheitsrisiko für den Patienten darstellt, dem es verabreicht wird. Ein mit Mikroorganismen kontaminiertes Medikament kann je nach Art und Menge des Mikroorganismus starke gesundheitliche Beeinträchtigungen wie z.B. Blutvergiftungen hervorrufen.

 

Wie wird die Prüfung auf Sterilität durchgeführt?

Die genaue Durchführung ist in den jeweiligen Kapiteln der relevanten Arzneibücher (z.B. Ph. Eur. 2.6.1., JP 4.06 oder USP <71>, [1-3]) beschrieben. Unterschieden wird zwischen dem Verfahren der Direktinokulation (Direktbeschickung) und dem der Membranfiltration. Sofern möglich, ist die Membranfiltration zu bevorzugen. Grundsätzlich wird unter aseptischen Bedingungen, z.B. in einem Steriltestisolator, gearbeitet.

Bei der Membranfiltration muss das zu untersuchende Produkt filtrierbar und wässrig, ethanolisch oder ölig sein. Zum Einsatz kommen entsprechende Filtrationseinheiten mit einer nominalen Porengröße von maximal 0.45 µm mit nachgewiesenem Bakterienrückhaltevermögen, einem Durchmesser von ca. 50 mm und einem für das zu untersuchende Produkt geeignetem Filtermaterial (z.B. Steritest von Merck). Nachdem die Membranen mit einer Pufferlösung (je nach Produkt: Fluid A, Fluid D oder Fluid K) befeuchtet wurden, wird das zu untersuchende Produkt filtriert, wobei im Falle einer Kontamination die vorhandenen Mikroorganismen auf der Filtermembran verbleiben. Danach folgt ein Spülschritt mit Pufferlösung (üblicherweise 3x 100 mL), welcher dazu dient, potenziell existierende antimikrobielle Eigenschaften des zu untersuchenden Produktes zu entfernen. Anschließend werden 2 verschiedene Flüssignährmedien (TSB und Thioglycolat-Bouillon à Fluid Thioglycollate Medium = FTM) in die Filtrationseinheiten gegeben und für 14 Tage (sofern nicht vorher schon Wachstum beobachtet wird) bei entsprechender Temperatur inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten werden die Einheiten visuell auf Trübung (d.h. Wachstum) kontrolliert.

Wenn das Produkt nicht filtergängig ist, wie z.B. chirurgisches Nahtmaterial, findet die Direktbeschickungsmethode Anwendung, bei der das Produkt direkt in das Nährmedium eingebracht wird (wobei es nicht mehr als 10% des Nährmedium-Volumens ausmachen darf) und ebenfalls nach Inkubation auf Trübung untersucht wird.

 

Wie findet die Eignungsprüfung des Steriltests statt?

Mit dem sogenannten method suitability test (MST, Eignungsprüfung, Verifizierung) soll der Nachweis erbracht werden, dass die Arzneibuchmethode auch unter den aktuellen Bedingungen im Labor, in welchem sie angewendet werden soll, den Anforderungen des Arzneibuchs für ihren vorgesehen Einsatzzweck entspricht. Mit der Eignungsprüfung wird der Beleg erbracht, dass das zu untersuchende Produkt keinen negativen Einfluss auf das Wachstum potentieller Mikroorganismen aufweist, also keine antimikrobiellen Eigenschaften hat bzw. diese ausreichend beseitigt wurden. Einfach gesagt, wir wollen also sicherstellen, dass im Falle einer Produktkontamination keine falsch-negativen Ergebnisse erhalten werden.

Daher wird im Rahmen der Eignungsprüfung für jedes der beiden verwendeten Nährmedien eine Wachstumskontrolle mit verschiedenen vermehrungsfähigen Mikroorganismen durchgeführt, die den Nährmedien in definierter Menge zugesetzt werden. Dies geschieht einmal in Ab- und einmal in Anwesenheit des zu untersuchenden Produktes. Die Durchführung in Abwesenheit des Produktes fungiert als Positivkontrolle, da wir hierbei mit dem Wachstum der zugesetzten Keime rechnen. Wenn man nun nach einer bestimmten Inkubationszeit die beiden Ansätze (1. mit Produkt und 2. Positivkontrolle) miteinander vergleicht und beide ein vergleichbares Wachstum zeigen, war die Eignungsprüfung erfolgreich. Falls das Nährmedium mit Produkt weniger bewachsen sein sollte, weist das Produkt wachstumshemmende Eigenschaften auf, die unter den gewählten Bedingungen noch nicht ausreichend beseitigt wurden. Entsprechend müssen die Prüfbedingungen angepasst werden, z.B. durch Anlegen von Verdünnungen oder Einsatz neutralisierender oder – im Falle von Antibiotika als zu testendem Produkt - inhibierender Agenzien, wie z.B. Polysorbaten oder β-Lactamasen.

Im Allgemeinen werden für einen MST die Analysen mit 3 unterschiedlichen Chargen des Produktes durchgeführt. Die Anzahl an zu untersuchenden Mustern pro Charge richtet sich dabei nach der Chargengröße insgesamt, die Arzneibücher geben hierfür genaue Vorgaben.

Die Durchführung des MSTs erfolgt analog der für den normalen Prüfablauf vom Arzneibuch vorgegeben Bedingungen (natürlich auch unter aseptischen Bedingungen 😉). Bei der Membranfiltrationsmethode werden die vom Arzneibuch vorgeschriebenen Testmikroorganismen (Staplylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium sporogenes, Candida albicans und Aspergillus brasiliensis, je maximal 100 KBE) im letzten Spülschritt zugesetzt. Diese Keime sind repräsentativ für mögliche bei der Produktion des Arzneimittels vorkommende Kontaminanten. Neben diesen Keimen kann man argumentieren, dass es durchaus auch Sinn macht, repräsentative Hauskeime, welche im Zuge des Umgebungsmonitorings in der Produktion detektiert wurden, ebenfalls im Rahmen der Eignungsprüfung mitzutesten. Anschließend wird das für die jeweilige zugesetzte Keimart vom Arzneibuch vorgegebene Nährmedium zugegeben (TSB für B. subtilis, C. albicans, A. brasiliensis und FTM für S. aureus, P. aeruginosa, C. sporogenes), gefolgt von der Inkubation bei der vom Arzneibuch für die jeweilige Keimart vorgeschriebenen Temperatur (20-25 bzw. 30-35°C) für maximal 3 (bei Bakterien) bzw. 5 Tage (bei Hefen und Schimmelpilzen). Die visuelle Überprüfung auf Trübung erfolgt dann täglich.

In obigem Versuchsaufbau haben wir zwar die Durchführung in An- und Abwesenheit des Produktes beschrieben, aber noch keine weiteren Kontrollen betrachtet. Neben der obigen Durchführung für den MST wird der Versuch außerdem parallel unter Routinebedingungen durchgeführt (also ohne die Zugabe der Testmikroorganismen) und es wird noch eine Negativkontrolle mitlaufen gelassen. Nach Ende der Inkubation sollte natürlich kein Wachstum bei der Routinedurchführung und der Negativkontrolle vorhanden sein. Mit Hilfe einer Tabelle lassen sich die 4 Ansätze gut veranschaulichen und ihr jeweiliger Zweck verdeutlichen:

  In Anwesenheit von Produkt In Abwesenheit von Produkt (Positivkontrolle) Routinedurchführung Negativkontrolle
1 Benetzen der Membran
2 Produkt filtrieren - Produkt filtrieren -
3 Spülen + Zugabe Testmikroorganismen Nur Spülen (KEINE Zugabe von Testmikroorganismen) 
4 Zugabe Nährmedium
5 Inkubation
Zweck Aussage zur Eignungsprüfung Nachweis, dass die im MST eingesetzten Produktchargen steril waren Nachweis, dass alle eingesetzten Reagenzien steril waren

Abschließend noch ein paar Worte zu den Nährmedien. Vor der Durchführung des MSTs sollten im Zuge der Wareneingangskontrolle die Sterilität sowie die wachstumsfördernden Eigenschaften der Nährmedien-Chargen, die im MST verwendet werden sollen, nachgewiesen worden sein. Zudem müssen die wachstumsfördernden Eigenschaften der Nährmedien natürlich auch noch am Ende der Inkubationszeit gegeben sein. Dies kann mit einem sogenannten Stasis-Test im Rahmen des MSTs nachgewiesen werden. Dieser soll zudem zeigen, dass auch das Arzneimittel die wachstumsfördernden Eigenschaften des Nährmediums nicht beeinträchtigt hat. Dazu werden nach der 14-tägigen Inkubationszeit des Routineansatzes die entsprechenden Testmikroorganismen zugegeben und entsprechend weiter inkubiert (Stasis Ansatz). Parallel wird eine Positivkontrolle mitgeführt, bei der frisches Medium mit den Testmikroorganismen beimpft wurde. Sollte das Wachstum des Stasis-Ansatzes mit dem der dazu mitgeführten Positivkontrolle vergleichbar sein, hat das Arzneimittel keinen negativen Einfluss auf die wachstumsfördernden Eigenschaften des Nährmediums und der Beweis ist erbracht, dass diese auch noch bei mehr als 14tägiger Inkubation gewährleistet sind. Natürlich sollte man auch hier eine Negativkontrolle mitführen 😉 Eine solche Überprüfung der wachstumsfördernden Eigenschaften nach 14täigiger Inkubation ist insbesondere bei Antibiotika als zu testendem Produkt im Zusammenhang mit Steritest-Filtereinheiten sinnvoll, da beobachtet wurde, dass geringe Mengen des Antibiotikums in den eingeschweißten Membranfilterrand diffundiert sind, diese bei der Spülung nicht ausgewaschen wurden, anschließend während der 14tägigen Inkubationszeit in das Nährmedium zurückdiffundierten und dabei ausreichend waren, das Wachstum der zugesetzten Testmikroorganismen zu inhibieren [4].

Ein Beispiel, welche Schwierigkeiten bei einer Verifizierung der Prüfung auf Sterilität von Vancomycin Augentropfen aufgetreten sind, zeigt das Poster der Arbeitsgruppe von Nicolas Cormier der CHU Nantes, welches im Oktober 2022 auf den 25. Europäischen Wissenschaftstagen der GERPAC präsentiert wurde [5].

 

Referenzen und weitere Literatur

[1] European Pharmacopoeia (Ph. Eur.), Kapitel 2.6.1 „Sterility“

[2] Japanese Pharmacopoeia (JP), Kapitel 4.06 „Sterility Test“

[3] United States Pharmacopoeia (USP) <71> „Sterility Tests“

[4] Concept Heidelberg (2015) Analytische Qualitätskontrolle und pharmazeutische Mikrobiologie, Editio Cantor Verlag, ISBN: 978-3-87193-424-7

[5] Rodrigo L., Bourget M., Olivier E., Cormier N. (2022) Development and validation of sterility method by membrane filtration of 5% vancomycin eye drops

PIC/S (2007) „Recommendations on Sterility Testing” (PI 0012-3)

TGA guidelines for sterility testing of therapeutic goods (2006)