Substanztrennungen mittels chromatographischer Methoden
Grundlegende Zusammenhänge und Schlussfolgerungen für Troubleshooting
Muss es immer HPLC sein?
Diese Drei: HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) / GC (Gaschromatografie) / TLC (Dünnschichtchromatografie) ergänzen sich sinnvoll zu einem mächtigen analytischen Werkzeug, um fast alle Trennaufgaben im Labor zu lösen.
Die GC war zuerst da. Warum? Es gehören weniger Komponenten zum technischen Aufbau als bei einem HPLC-System, z.B. keine Hochdruck-Pumpe bei der GC (siehe Tabelle 1). Das heisst, die technische Entwicklung war schon in den 1950zigern möglich. Die Analyte werden einzig mit dem Gasstrom vom Injektor über die Trennsäule zum Detektor transportiert. Mit der GC können Substanzgemische analysiert werden, bei denen die Substanzen verdampfbar sind. Die GC ist quantitativ für flüchtige Substanzen.
Es ist recht einfache GC-MS-Kopplung möglich. Aber die quantitative Analytik von organischen nicht flüchtigen Substanzen ist nur mit der HPLC möglich. D.h. ein Großteil der Lebensmittel- und Umweltanalytik wäre ohne HPLC nicht machbar.
Tabelle 1: Wesentliche Bestandteile eines GC- bzw. HPLC-Systems
| GC-System | HPLC-System |
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Schon aufgrund der Komponentenliste ist eine Systematik bei der Fehlersuche möglich.
Die Van Deemter Gleichung stellt den Zusammenhang zwischen Bodenhöhe (H) und Trennstufenzahl (N), also die Begründung für die Leistungsfähigkeit eines chromatographischen Verfahrens dar. Wenn die Kurve sehr flach ist, spielt die Korngröße in der Säule eine sehr geringe Rolle.
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Empirische Van Deemter Gleichung: H = A n0,33 ... + ... B/n ... + ... C n H = Bodenhöhe A = Anteil der Eddy-Diffusion und Strömungsverteilung (1) B = Anteil der Längsdiffusion (2) C = Stoffaustauschanteil (3) n = u = Fließgeschwindigkeit |
Lit.: Veronika Meyer: „Praxis der Hochleistungsflüssigchromatographie“, Otto Salle Verlag 1992, ISBN 3-7941-2792-7, S. 16ff, S. 19 und S. 104 |
Abbildung 1: Van Deemter Gleichung
Kleines Trouble Shooting - Ursachen von Bandenverbreiterung
Für die Bandenverbreiterung, die man sich als Zunahme der Halbwertsbreite eines Peaks in einem Chromatogramm vorstellen kann [Anm. d. Red.: siehe dazu auch unseren Blogbeitrag "HPLC: Was tun bei zu breiten Peaks?], gibt es mehrere Ursachen.
Eine gute Säule hat normalerweise eine hohe Trennstufenzahl. Je geringer die Bandenverbreiterung auf einer Säule, desto größer ist die Trennstufenzahl. Welche Prozesse in einer Säule spielen dafür eine Rolle?
1. Ursache: A = Eddy-Diffusion (Streudiffusion)
Einige Moleküle kommen schnell durch die Säule und andere geraten auf mehr oder weniger große Umwege. Der Peak beginnt, wenn die ersten Moleküle einer Substanz am Detektor erscheinen und ist erst beendet, wenn die letzten Moleküle den Detektor verlassen haben.
2. Ursache: Strömungsverteilung
Die mobile Phase fließt durch die Kanäle der stationären Phase, d.h. durch die Kornzwischenräume hindurch. Sind die Kornzwischenräume sehr ungleichmäßig, gibt es eine ungleichmäßige Strömungsverteilung. Je ungleichmäßiger die Strömungsverteilung, desto breiter wird die Bande (Peak). Abhilfe schafft eine Säule gefüllt mit Körnern einheitlicher Größe. Die Eddy-Diffusion und die Strömungsverteilung sind umso geringer, je enger die Korngrößenverteilung der Säule ist. Dieses ist ein Qualitätsmerkmal einer Säule.
3. Ursache: B = Längsdiffusion
Längsdiffusion bedeutet die Diffusion der Probenmoleküle in der mobilen Phase. Dieser Effekt spielt in der GC eine sehr wichtige Rolle. Die Längsdiffusion wirkt nachteilig auf die Bodenhöhe wenn das Korn <10 µm ist, wenn die mobile Phase eine geringe Strömungsgeschwindigkeit aufweist und die Probenmoleküle einen großen Diffusionskoeffizienten besitzen.
4. Ursache: C = Stoffaustausch
Die Bandenverbreiterung ist umso geringer, je kürzer die Pore des Kornes ist. Je kleiner das Partikel, desto kürzer sind die Poren.
Aufgrund dieser Vorgänge in der Säule nimmt die Bandenverbreiterung mit steigender Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase zu. Der zeitliche Abstand zwischen den Molekülen in der strömenden mobilen Phase und den in der Pore befindlichen Molekülen wird also mit steigender Fließgeschwindigkeit größer, d.h. der Peak wird breiter. Man muss also ein optimales Verhältnis zwischen Fließgeschwindigkeit und Porengröße, d.h. Korngröße finden. Für jede Korngröße gibt es eine eigene Van Deemter Kurve. Daraus kann man die optimale Fließgeschwindigkeit uoptimal für die jeweilige Korngröße ablesen.
Die Kurve 4 aus Abbildung 1 zeigt beispielsweise die Korngröße 5 µm, bei dieser ist 1 mL/min die optimale Flußrate bei MeOH / Wasser-Gemischen als mobile Phase. Der Unterschied zwischen Flußrate und Fließgeschwindigkeit besteht in der Einheit. Die Fließgeschwindigkeit gibt die Wegstrecke wieder, die sich ein Molekül in einer Zeit durch die Säule bewegt in z.B. cm/min.
Bei der TLC ist die Quantifizierung schwieriger. Sie ist aber eine gute Möglichkeit, passende Gemische der mobilen Phase zu ermitteln.
Gegenüberstellung HPLC und TLC (Ergänzung durch die Lösungsfabrik)
Die nachfolgende kleine Gegenüberstellung zeigt exemplarisch einige Vor- und Nachteile beider Verfahren:
| HPLC | TLC |
| + besser automatisierbar und sehr viel genauer als TLC | |
| - Detektion oft nur bei 1 Wellenlänge | + Detektion aller Stoffe auf der gesamten Platte |
| - Verschmutzung der Säule möglich | + einmalige Verwendung der Platten |
| - teure Säulen und Reagenzien | + sehr günstige TLC-Platten |
| + gleichzeitige Trennung meherer Proben auf 1 Platte |
Über die Autorin
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Dr. Sabine Kapelle ist Service and Sales Manager der Firma AdvaTec Analytics GmbH & Co. KG (http://advatec-analytics.com/). Als promovierte Chemikerin mit über 26jähriger Berufserfahrung im Bereich Chromatografie und Spektroskopie teilt sie bei AdvaTec ihr Wissen mit Kunden im Rahmen der Kundenbetreuung und bei Schulungen. AdvaTec bietet Leistungen und Services rund um Systeme und Applikationen in der Analytik. Dies umfasst die Planung von Systemen und neuen Prozessen sowie deren Optimierung, aber auch die Wartung, Fehlerbehebung und Instandsetzung von Geräten. Des Weiteren werden beispielsweise In-House Schulungen zu HPLC-, GC- und anderen Analysesystemen sowie zum Troubleshooting angeboten. Neben den Dienstleistungen rundet der Verkauf von Geräten und Ersatzteilen das Angebot ab. |
