Peak-Symmetrie, Asymmetrie und ihre Ursachen bei der HPLC
In einem anderen Blogbeitrag haben wir uns im Zuge des Themas „HPLC: Was tun bei zu breiten Peaks?“ bereits mit der Problematik von Peak-Verbreiterungen beschäftigt. Unser Fokus lag dabei auf symmetrischen breiten Peaks. Nun wollen wir uns den asymmetrischen Peaks widmen.
Fronting und Tailing – was ist das überhaupt?
Ein Peak gilt als asymmetrisch, wenn der Abstand von Beginn des Peaks zur Peakspitze (Abstand A) sich von dem Abstand der Peakspitze zum Ende des Peaks unterscheidet (Abstand B). Am besten misst man diese Abstände bei ca. 10 % der Peakhöhe. Ist Abstand A größer als Abstand B, spricht man von „Fronting“ (oder „Leading“). Ist Abstand A kleiner als B, nennt man dies „Tailing“. Beides kann ähnliche, aber auch ganz unterschiedliche Ursachen haben, von denen wir hier einige besprechen wollen.
Tailing kann vielfältige Ursachen haben
Beobachtet man Tailing bei allen Peaks, sollte man unterscheiden: Bestand das Problem von Anfang an, oder wurde das Tailing im Laufe der Messungen stärker? Ob das Tailing im Laufe der HPLC-Messungen zunimmt, lässt sich am besten im Vergleich mit einem älteren Chromatogramm nachvollziehen. Zeigt das Chromatogramm der aktuellsten Messung deutlich mehr Tailing, ist das ein klarer Hinweis auf zunehmende Verschmutzung des HPLC-Systems oder schlichtweg die Alterung der Säule. Zunächst sollte dann die Vorsäule ausgetauscht und gegebenenfalls die Laufmittel frisch hergestellt werden. Besteht das Problem weiterhin, kann die Säule im besten Fall an einer zweiten HPLC getestet werden (siehe auch Blogbeitrag „HPLC: Was tun bei zu breiten Peaks?“). Zeigt das Chromatogramm starkes Tailing, liegt das Problem bei der Säule selbst. Je nach Alter und gelaufener Probenanzahl kann eine ordentliche Reinigung der Säule durch Spülung über Nacht das Problem lösen. Ist die Säule schon eine Weile im Einsatz, kann auch das Säulenmaterial an sich Ursache des Tailings sein. Jede Säule hat nur eine begrenzte Lebenszeit. Je nach Probentyp und HPLC-Methode kann dies nach Fünfhundert oder mehreren Tausend Proben der Fall sein. Isokratische Methoden gelten dabei als säulenschonender. Zu hohe Flussraten, Temperaturen und der Einsatz sehr starker Lösungsmittel oder auch ein zu hoher oder niedriger pH-Wert (siehe unten) können die Säulenalterung beschleunigen.
Wenn das Tailing von Anfang an beobachtet wurde, ist es aller Wahrscheinlichkeit nach ein chemisches Problem. Insbesondere basische Substanzen zeigen bei Überladung ein Peaktailing. Hier heißt es: Probe verdünnen oder Probenvolumen deutlich reduzieren. Aber auch der pH-Wert des Laufmittels kann zur Asymmetrie von Peaks führen. Die Ursache eines pH-bedingten Tailing oder Fronting liegt in der chemischen Natur der zu analysierenden Probe. Grundsätzlich kann man sich merken: Im sauren Bereich liegen die meisten Substanzen protoniert vor. Bei basischen Substanzen bedeutet dies eine Ionisierung (positive Ladung, z.B. R-NH3+), während saure Substanzen ungeladen vorliegen. Im alkalischen Bereich hingegen liegen die Substanzen entsprechend deprotoniert vor: Basische Substanzen sind ungeladen, saure Substanzen erhalten eine negative Ladung (z.B. R-COO-). Liegt der pH-Wert des Laufmittels exakt bei dem Wert der Säurekonstante, also dem pKS-Wert der Probensubstanz, liegt theoretisch die Hälfte der Moleküle einer Substanz geladen und die andere Hälfte ungeladen vor. Der Teil mit einer Ladung ist polarer und geht beispielsweise mit dem apolaren Umkehrphasen-Säulenmaterial („reversed phase“, RP) weniger Wechselwirkungen ein als der ungeladene Teil. Dies führt zu unterschiedlich starken Wechselwirkungen an der Säule, was zur Peak-Verbreiterung führen kann. Je nach Verteilung zwischen geladenen und ungeladenen Molekülen einer Substanz kommt es dabei zu Fronting oder Tailing. Zu beachten ist, dass auch der Anteil organischen Lösungsmittels im wässrigen Puffer einen Einfluss auf den pKS-Wert hat und so die Ionisierung beeinflussen kann. Um Fronting oder Tailing aufgrund des pH-Wertes zu vermeiden, sollte man beim Laufmittel einen pH-Wert wählen, der entweder weit unterhalb oder weit oberhalb des pKS-Wertes der zu analysierenden Substanz liegt.
Das weiter oben beschriebene Tailing aufgrund der Säulenalterung hat zu einem gewissen Teil oft auch mit dem pH-Wert des Laufmittels zu tun. Bei der Umkehrphasen-HPLC sind die Silanolgruppen des Kieselgels mit langen Kohlenstoffketten (z.B. C18) modifiziert. Freibleibende Silanolgruppen werden oft mit Trimethylsilylgruppen maskiert („endcapping“), um die polaren bzw. ionischen Wechselwirkungen zu unterbinden. Im Laufe des Säulenlebens kann es zu Verlust dieser Gruppen unter Freisetzung der Silanolgruppen kommen („Bleeding“). So können positiv geladene Probenbestandteile ionische Wechselwirkungen mit den Silanolgruppen eingehen, was bei gealterten HPLC-Säulen zu einem Tailing führen kann.
Typische Ursachen von Fronting
Bei einem Fronting ist der erste Gedanke eines Analytikers: „Überladung“. Hierbei muss unterschieden werden zwischen der Überladung mit Probenmaterial und der Überladung mit Probenvolumen. Die Überladung der Säule mit zu viel Probenmaterial ist ein gängiges Problem bei Proben unbekannter Konzentration oder Verdünnungsfehlern – insbesondere bei neutralen und sauren Probensubstanzen. Dieses Problem lässt sich schnell beheben: Einfach die Probe verdünnen oder weniger Probe injizieren. Oft ist damit bereits das Problem gelöst und die Probe war schlichtweg zu stark konzentriert. Falls nicht, sollte ein Blick auf den pH-Wert des Laufmittels geworfen werden.
Zeigen die Peaks eines Chromatogramms eine eher flache und asymmetrisch nach vorn verlagerte Form, so dass es fast aussieht wie ein Doppelpeak (Splitpeak), ist oft ein zu starkes Probenlösungsmittel die Ursache. Die Injektion der Probe in zu starkem Lösungsmittel führt dazu, dass die Bestandteile der Probe mit dem Lösungsmittel mitgeschwemmt werden, anstatt sich vernünftig an die Säule binden zu können. Wenn möglich sollten daher die HPLC-Proben immer in derselben mobilen Phase gelöst werden, die den Anfangsbedingungen des HPLC-Laufs entspricht. Bei schwer löslichen Proben muss das zu injizierende Probenvolumen soweit reduziert werden, dass der Einfluss des starken Probenlösungsmittels auf die Säule nicht mehr zu merken ist. Grundsätzlich sollte jedoch ein größeres schwach konzentriertes Probenvolumen gelöst in der mobilen Phase einem kleinen hochkonzentrierten Probenvolumen in starkem Lösungsmittel vorgezogen werden. Ein weiterer Grund für ein Fronting ist eine zu geringe Säulentemperatur. Dieses Problem ist durch den Einsatz eines Säulenofens leicht zu lösen.
Da Fehlersuche bei der HPLC sehr zeitaufwendig ist, hoffen wir, mit diesem Blogbeitrag Hilfestellung geben zu können und Lösungsideen aufgezeigt zu haben.