Was bedeuten eigentlich „dilution integrity“, „dilution linearity“ und „parallelism“?

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Eine Anfrage über unsere Homepage hat mich dazu veranlasst, mich einmal intensiver mit den Begriffen „dilution integrity“, „dilution linearity“ und „parallelism“ zu beschäftigen. Sie alle entstammen dem Bereich der Validierung bioanalytischer Methoden, also solcher, bei denen eine biologische Probe wie beispielsweise menschliches oder tierisches Blut oder Urin untersucht wird. Solche Analysen sind im Rahmen präklinischer und klinischer Studien bei der Entwicklung von Arzneimitteln notwendig. Die dafür anzuwendenden Analysemethoden wie z.B. LC- oder GC-MS oder Ligandenbindungsassays (LBA) sind natürlich vor ihrem Einsatz zu validieren. Im Gegensatz zur Validierung analytischer Methoden für bereits zugelassene Arzneimittel existiert derzeit keine harmonisierte Richtlinie bezüglich der Anforderungen für die Validierung bioanalytischer Methoden. So haben die unterschiedlichen Behörden ihre eigenen Richtlinien herausgegeben, siehe auch unseren Blogartikel dazu. Entsprechend kann es leicht zu Verwirrungen kommen. In diesem Blogartikel möchten wir die 3 Begriffe genauer erklären und gegeneinander abgrenzen.

Vorweg soll gesagt werden, dass sich alle 3 Begriffe grundsätzlich mit dem Effekt der Verdünnung von „Proben“ beschäftigen, auch wenn später noch auf die eingesetzten Proben im Detail eingegangen werden muss.

 

Dilution integrity und dilution(al) linearity

Die Begriffe dilution integrity und dilution(al) linearity sind sich von ihrer Bedeutung sehr ähnlich, beide sollen zeigen, dass eine Probe, die eine Analyt-Konzentration außerhalb (genauer oberhalb) des validierten Bereichs aufweist, durch die Verdünnung in den messbaren Bereich gebracht werden kann. Dafür werden sogenannte QC samples eingesetzt, das ist die biologische Matrix (also z.B. Blut ohne Analyt), die dann mit einer definierten Menge des Analyten gespikt wird, so dass die resultierende Analyt-Konzentration bekannt ist. Diese sollte oberhalb des ULOQ (upper limit of quantification) liegen. So weit so gut. Dies gilt für beide Begriffe, aber es gibt zwei wesentliche Unterschiede:

  1. Dilution integrity wird für chromatografische Methoden, während dilution(al) linearity für Ligandenbindungsassays wie z.B. ELISAs angewandt. [Zumindest gilt das so bei der Guideline der EMA und den beiden japanischen. Mit der Guideline der FDA ist es leider etwas komplizierter, da dort die Definition der dilutional linearity eher in Richtung der dilutional integrity geht. Womit wir beim nächsten Punkt sind:]
  2. Dadurch, dass der Begriff dilutional linearity für LBAs gilt, ist seine Definition etwas weiter gefasst als die der dilutional integrity. Dilutional linearity soll nämlich neben obigem Ziel auch den Nachweis erbringen, dass kein Hook- oder Prozone-Effekt auftritt. Dieses Artefakt tritt bei sehr hohen Analyt-Konzentrationen auf und zeigt sich dadurch, dass sich das Ergebnis unabhängig von der angewandten Verdünnung nicht ändert oder sogar absurderweise bei höheren Konzentrationen niedriger wird.

Der Unterschied dieser beiden Begrifflichkeiten wird sehr schön im Fragen-und-Antworten-Teil der japanischen Guideline für Ligandenbindungsassays zusammengefasst: „Dilution integrity is tested to confirm that the dilution procedure has no impact on the measured concentration, while dilutional linearity is tested to confirm not only dilution integrity, but also the absence or presence of a hook effect or prozone.”

 

Parallelism

Parallelism ist ein Begriff, der wieder nur auf die Ligandenbindungsassays bezogen ist. Im Gegensatz zu dilution linearity / integrity wird hierbei als Probe eine sogenannte incurred oder study sample eingesetzt. Das ist eine „richtige“ Probe, die von einem Menschen oder Tier erhalten wurde, die dem in der Entwicklung befindlichen, zu testenden Arzneimittel ausgesetzt waren. Diese Probe soll eine hohe endogene Analyt-Konzentration aufweisen (und nicht wie die QC Probe gespikt werden). Genau wie oben wird auch hier eine Verdünnungsreihe angelegt, aber diese wird mit der des Kalibrierstandards verglichen und sollte einen parallelen Verlauf aufweisen. Der Sinn dahinter ist die Detektion potentieller Matrix-Effekte und der Nachweis, dass die Bindeaffinität des Analyten in der Probe zu den Antikörpern genauso so hoch ist wie die des Kalibrierstandards.

 

Die nachfolgende Tabelle fasst noch einmal die wesentlichen Punkte zusammen:

  Dilution integrity  Dilution linearity Parallelism
 Methodentyp  Chromatografie LBA  LBA
 Probe  QC sample  QC sample  Incurred / study sample
 Zweck Allg. Verdünnbarkeit einer Probe von außerhalb ULOQ in den validierten Bereich

a) siehe dilution integrity

 b) + Nachweis der Abwesenheit eines Hook- / Prozone-Effekts

Verdünnbarkeit einer richtigen Probe mit gleichem Verlauf wie Kalibrierstandard (u.a. Abwesenheit von Matrix-Effekten)

Tags: Methodenvalidierung bioanalytische Methoden

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