Ableitung der Genauigkeit aus der Linearität – Weg 2: Wiederfindung

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Nachdem wir im letzten Blogbeitrag den ersten Lösungsweg (--> Normalisierung) für die Ermittlung der Genauigkeit bei Methodenvalidierungen, bei denen es keine Unreinheiten zum Spiken oder Alternativmethoden gibt, betrachtet haben, wollen wir uns heute den zweiten Lösungsweg ansehen.

Wir bleiben bei unserem Beispiel vom letzten Mal, wo eine SE-HPLC zur Bestimmung der Reinheit eingesetzt werden soll. Die Verunreinigungen werden als Summe der Nebenpeaks angegeben, während es sich bei dem Hauptpeak um unser gewünschtes Produkt handelt. Unser grundsätzlicher Ansatz besteht wie letztes Mal darin, die Genauigkeit aus der Linearität abzuleiten, da dies bei gegebener Spezifität (dies setzten wir wieder voraus) und Präzision entsprechend der Validierungsrichtlinie ICH Q2(R1) erlaubt ist.

Wir nehmen uns also den bereits bekannten Datensatz (5 Konzentrationen für die Linearität mit je drei unabhängig angesetzten Replikaten):

  Absolute Peakfläche [µAU*s]
Untersuchungs-level (%) Summe der Nebenpeaks Hauptpeak
120  99104  15949990
 96153  15988085
 97723  15879248
110 89383  14567078
 87474  14592610
 88355  14558575
100  77587  13275901
 76162  13264078
 78209  13285496
90 65802  11513839
67811  11937356
68012  12037029
80 54208  10489899
55611  10594228
56819  10683872

und stellen die Linearität jetzt grafisch dar (wobei wir aus Vereinfachungsgründen anstatt der eigentlichen Konzentration in mg/mL des Produktes bzw. der Verunreinigungen das Untersuchungslevel in % angegeben haben):

Diese Abbildungen helfen uns, da wir jetzt die theoretischen absoluten Peakflächen mit Hilfe der jeweiligen Regressionsgerade (y = m * x + n) ausrechnen wollen. Natürlich können wir dafür in Excel auch die Formeln ACHSENABSCHNITT(Y_Werte;X_Werte) für den y-Achsenabschnitt (n) und STEIGUNG(Y_Werte;X_Werte) für die Steigung (m) verwenden. Damit haben wir folgende Parameter unserer beiden Regressionsgeraden:

  Steigung m
y-Achsenabschnitt n
RegressionsgeradeSumme der Nebenpeaks
1054,2 -28196
RegressionsgeradeHauptpeak 134429 -201743

Wenn wir jetzt in die Regressionsgerade y = m*x + n für x die Untersuchungslevel einsetzen (z.B. 1054,2 * 120 + (-28196) = 98312), erhalten wir folgende Daten:

  Absolute Peakfläche [µAU*s]
Untersuchungs-level (%) Summe der Nebenpeaks Hauptpeak
 120  98312  15929731
 110  87770  14585442
 100  77227  13241152
 90  66685  11896863
 80  56143  10552573

Wir erinnern uns, dass wir für die Bestimmung der Richtigkeit gemessene Werte mit theoretischen Werten vergleichen müssen. Das können wir jetzt tun und die „Güte“ unserer Messwerte mit Hilfe der Wiederfindungsrate (recovery) bestimmen (= gemessener Wert / theoretischen Wert * 100%). Sie zeigt uns, wie nah unsere gemessenen Werte an den theoretischen Werten dran sind.

  Summe der Nebenpeaks     Hauptpeak
Untersuchungs-level (%)  Gemessener Wert Theoretischer Wert  Wiederfindungsrate [%]  Gemessener Wert Theoretischer Wert Wiederfindungsrate [%]
120  99104  98312 101  15949990 15929731 100
 96153 98  15988085 100
 97723 99  15879248 100
110  89383 87770 102  14567078 14585442 100
 87474 100  14592610 100
 88355 101  14558575 100
100  77587 77227 100  13275901 13241152 100
 76162 99  13264078 100
 78209 101  13285496 100
90  65802 66685 99  11513839 11896863 97
 67811 102  11937356 100
 68012 102  12037029 101
80  54208 56143 97  10489899  10552573 99
 55611 99  10594228 100
 56819 101  10683872 101

Bei Betrachtung der Wiederfindungsraten stellen wir fest, dass alle gemessenen Werte zu fast 100% dem jeweiligen theoretischen Wert entsprechen. Super!

Wenn dies wissenschaftlich vernünftig begründet werden kann, kann es im Rahmen einer Validierung durchaus ausreichend sein, für die Ermittlung der Genauigkeit nur die Wiederfindungsrate für den Hauptpeak basierend auf den absoluten Peakflächen zu bestimmen und zusätzlich für beide Parameter (Summe der Nebenpeaks und Hauptpeak) jeweils noch die Präzision mit Hilfe der relativen Peakflächen (wie bereits im letzten Blogartikel gezeigt).

Tags: Methodenvalidierung Lineare Regression Reinheit Linearitaet Genauigkeit Wiederfindung

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