HPLC Druckschwankungen

Geschrieben von Eva Arnold Veröffentlicht in HPLC

Bei der HPLC-Anlage steht alles miteinander im Zusammenhang. Es gibt nicht „die“ eine Lösung für „das“ eine Problem. Druck ist für eine Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) natürlich völlig normal. Es handelt sich hierbei um den Rückdruck der Laufmittel, die durch sehr enge Kapillaren auf eine dicht gepackte Säule gepumpt werden. Was kann da schon schiefgehen? Vieles!

Veränderungen im Druck einer HPLC-Anlage können sehr unterschiedliche Gründe haben und gehen oft einher mit anderen typischen HPLC-Problemen. Aus diesem Grund ist die Behebung eines Druckproblems nicht ganz einfach, zudem es erst einmal erkannt werden muss. Das Auftreten von Peakverbreiterungen, Doppelpeaks, Geisterpeaks, starkem Rauschen der Basislinie oder veränderten Retentionszeiten hängt sehr oft mit einer Druckproblematik zusammen, daher lohnt es sich immer, ein Auge auf den Druck zu haben. Die regelmäßige Kontrolle des Drucks kann aus diesem Grund das Auftreten dieser Probleme vermeiden.

Besonders schleichende Druckveränderungen können nur bemerkt werden, wenn regelmäßig der Druck beobachtet wird. In regelmäßigen Abständen, spätestens bei jedem Vorsäulenwechsel, sollte daher der Rückdruck des HPLC-Systems notiert werden. Die Verwendung einer Vorsäule bietet sich grundsätzlich immer an, selbst bei der Untersuchung von „sauberen“ Proben: Der ganz normale Materialabrieb der HPLC-Pumpen kann ausreichend sein, um die Haltbarkeit von Säulen zu beeinträchtigen. Am besten lässt sich der Rückdruck mit einem standardisierten HPLC-Lauf bestimmen, der nicht verändert wird. Grundsätzlich sollte man aber immer auf den Druck achten, selbst – oder gerade – bei Routinemessungen. Um druckbedingte Säulen- oder Geräteschädigungen zu verhindern, sollte in der HPLC-Software ein Maximaldruck eingestellt werden, bei dessen Überschreitung die Pumpe automatisch abschaltet. Hierbei sollten das Drucklimit der HPLC-Anlage und der verwendeten Säule beachtet werden (nachzulesen in den Herstellerangaben).

 

Sie haben also Druckschwankungen bei Ihrer HPLC-Anlage?

Gerade wenn man routiniert bei der Arbeit ist, übersieht man oft das ganz Offensichtliche. Überprüfen Sie daher zunächst, ob das System richtig angeschlossen ist (Alle Kapillaren verbunden? Gibt es Lecks?). Ist die mobile Phase leer und wurde vielleicht bereits Luft angesaugt? Lecks und Luft in den Pumpenköpfen können einen geringen bis kaum vorhandenen Druck erklären. Eine weitere, einfache Erklärung ist eine zu niedrig eingestellte Flussrate, wie auch eine zu hohe Flussrate für einen zu hohen Druck sorgt. Je nach Säulendimension gibt es eine bestimmte Idealflussrate, die am besten geeignet ist. Eine zu hohe Flussrate kann die Säule schädigen.

 

Einige Druckschwankungen innerhalb eines Laufs sind ganz normal

Insbesondere bei Programmen mit einem Gradienten kann es zu Druckveränderungen kommen, die sich aufgrund der Viskosität von Lösungsmitteln und ihren Mischungen erklären lassen. Insbesondere Gradienten von Wasser zu Methanol oder Tetrahydrofuran (THF) zeigen bei ihrer Mischung einen starken Druckanstieg. Dieser Druck ist nicht zu unterschätzen (mehr als doppelt so hoch bei 50% Methanol / 50% Wasser im Vergleich zu 100% Methanol) und sollte bei Etablierung von neuen Methoden gut beobachtet werden, um eine Schädigung der Anlage oder Säule zu verhindern. Achten Sie immer darauf, dass die verwendeten Laufmittel miteinander mischbar sind! Bestimmen Sie die Gradienten-typischen Druckveränderungen, indem Sie einen Lauf ohne Probeninjektion durchführen und die Druckschwankungen notieren. Hierbei ist oft auch ein Basisliniendrift zu erkennen, der bei manchen Gradienten ganz normal ist.

Manchmal ist eine Druckspitze kurz nach der Probeninjektion zu beobachten. Gerade bei größeren Injektionsvolumina kann das normal sein. Das bei Injektion neu hinzugefügte Volumen führt zu einem kurzen Überdruck. Handelt es sich noch dazu um ein Lösungsmittel höherer Viskosität, kann sich der Druck kurzzeitig sogar mehr als verdoppeln. Nutzen Sie daher wenn möglich als Probenlösungsmittel dieselbe Komposition wie die des verwendeten Laufmittels (zu Beginn des Laufs). Injizieren Sie das Probenlösungsmittel („Blank“), um die Druckveränderungen zu messen. Kommt es bei Injektion einer Probe zu deutlich höheren Drücken als bei dem Probenlösungsmittel allein, sollte die Probe vorher gefiltert oder aufgereinigt werden.

 

Woher kommen sinusförmige Druckänderungen bei gleichmäßiger Flussrate?

Eben haben wir die Druckänderungen aufgrund eines Gradienten geklärt. Bei einem Gradienten kann sich der Druck also während des Laufs erhöhen und gegen Ende wieder absinken. Ganz anders ist es mit regelmäßigem „sinusförmig“ schwankenden Druck bei einer gleichbleibenden Flussrate. Oft tritt ein passendes, sinusförmiges Muster der Basislinie als Begleiterscheinung auf. Erhöht man die Flussrate, erhöht sich auch die Frequenz der Druckschwankung. Das Problem liegt hier also bei den Pumpen. Hierbei kann es sich um Luftblasen in den Pumpenköpfen handeln, die durch Entlüftung beseitigt werden können. Bringt die Entlüftung des Systems nichts, kann ein fehlender Rückdruck der Grund für diese Schwankungen sein. Ein fehlender Rückdruck führt zu Druckschwankungen aufgrund der Pumpenbewegungen. Moderne HPLC-Geräte haben daher oft einen Pulsdämpfer eingebaut.

Hilft das alles nichts, könnten die Ventile und Dichtungen der Pumpen durch Abnutzung undicht geworden sein und sollten ausgetauscht werden. Bevor Sie eine teure Bestellung aufgeben, sollten Sie aber einen Blick auf die Säule werfen: eine lange nicht benutzte Säule kann im Laufe ihrer Lagerungszeit austrocknen und bei Wiederanschluss ebenfalls zu solchen Druckschwankungen führen.

 

Zu hoher Druck?

Ist der Druck deutlich zu hoch, sollten Sie zuerst überprüfen, ob ein Vorsäulenaustausch nötig ist. Zusätzlich sollten Sie nachschauen, welche Proben zuletzt gelaufen sind. Möglicherweise haben die Proben Schwebteilchen und Verunreinigungen eingebracht, die nun zur Verstopfung des Probeninjektionssystems oder einzelner Kapillaren führen. In diesem Fall sollten Sie über eine Filtration, Zentrifugation oder Voraufreinigung (z.B. Festphasenextraktion) der Proben nachdenken, wenn Sie nicht alle paar Proben eine Verstopfung des Kapillarsystems oder der Vorsäule riskieren wollen. Auch das verwendete Laufmittel kann die Ursache sein: Insbesondere selbstgemischte, wässrige Phasen müssen gut filtriert werden, um Bakterienwachstum zu verringern und Schwebteile zu entfernen. Bei Zusätzen wie Salz achten Sie darauf, dass alles gut gelöst ist und nichts ausfällt, insbesondere bei Gradientenläufen mit Lösungsmitteln.

Bevor Sie anfangen, die ganze Anlage auseinander zu nehmen, überprüfen Sie auch hier die offensichtlichen Dinge: Ist die Flussrate zu hoch eingestellt? Wird ein Lösungsmittelgemisch mit hoher Viskosität verwendet (z.B. Methanol/Wasser 50:50)? Auch eine zu geringe Temperatur des Säulenofens kann zu einem erhöhten Druck führen.

Wenn ein Vorsäulenaustausch nichts geholfen hat, liegt vermutlich eine Verstopfung in der HPLC-Anlage vor. Zur Lokalisation der betroffenen Komponente tauscht man am besten einzelne Komponenten aus und geht dabei am besten rückwärts vor: Beginnen Sie mit der Auslasskapillare, die vom Detektor zum Abfallkanister führt, dann tauschen Sie die Kapillare zwischen Säule und Detektor aus. Sofern Sie eine neue Säule zur Verfügung haben, tauschen Sie auch die Säule aus. Anschließend überbrücken Sie das Injektionsventil bzw. Autosampler. Wenn der Druck bis hier weiterhin zu hoch ist, liegt das Problem bei den Pumpen und Sie sollten einen Techniker zu Rate ziehen.

 

Was, wenn der Druck zu niedrig ist?

Besonders geringer Druckabfall wird häufig nicht ernst genommen. Bei schlechter Wartung kann ein zu geringer Druck durch Kombination mit verstopfter Kapillare oder Vorsäule maskiert werden und unerkannt bleiben. Oft äußert sich das in anderen Problemen wie schlechte Reproduzierbarkeit und Wiederfindungsrate sowie starkes Rauschen der Basislinie. Wenn der Basisdruck regelmäßig notiert und überprüft wird, ist ein leichter Druckabfall schnell zu bemerken.

In jedem Fall sollten bei einem Druckabfall alle Verbindungen auf Lecks untersucht werden. Stabiler, zu niedriger Druck kann ein Zeichen für ein kleines Leck oder Luftblasen im Pumpensystem sein. Vergessen Sie nicht die offensichtlichen Gründe, wie eine zu niedrige Flussrate oder abweichende Säulentemperatur. Auch ein blockierter Ansaugfilter in der Laufmittelflasche kann zu verringertem Druck führen. Wurden Lecks ausgeschlossen, befindet sich vermutlich Luft im System, was sich oft in Kombination mit einem Rauschen der Basislinie und fehlenden Peaks bemerkbar macht.

Kommt es zu einem starken, plötzlichen Druckabfall, sollten Sie sofort überprüfen, ob die Pumpen Luft angesaugt haben oder eine Kapillare aus einer Verbindung gerutscht ist und ein großes Leck verursacht hat.

 

Die Fehlersuche bei der HPLC kann Zeit und Nerven kosten, das wissen wir aus eigener Erfahrung. Wir hoffen, dass wir Ihnen mit diesem Blogeintrag über eines der wichtigsten Themen des HPLC-Troubleshootings helfen konnten, ein Problem zu lösen oder Ihnen zumindest einen Lösungsansatz geben konnten.