Ableitung der Genauigkeit aus der Linearität – Weg 2: Wiederfindung

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Nachdem wir im letzten Blogbeitrag den ersten Lösungsweg (--> Normalisierung) für die Ermittlung der Genauigkeit bei Methodenvalidierungen, bei denen es keine Unreinheiten zum Spiken oder Alternativmethoden gibt, betrachtet haben, wollen wir uns heute den zweiten Lösungsweg ansehen.

Wir bleiben bei unserem Beispiel vom letzten Mal, wo eine SE-HPLC zur Bestimmung der Reinheit eingesetzt werden soll. Die Verunreinigungen werden als Summe der Nebenpeaks angegeben, während es sich bei dem Hauptpeak um unser gewünschtes Produkt handelt. Unser grundsätzlicher Ansatz besteht wie letztes Mal darin, die Genauigkeit aus der Linearität abzuleiten, da dies bei gegebener Spezifität (dies setzten wir wieder voraus) und Präzision entsprechend der Validierungsrichtlinie ICH Q2(R1) erlaubt ist.

Wir nehmen uns also den bereits bekannten Datensatz (5 Konzentrationen für die Linearität mit je drei unabhängig angesetzten Replikaten):

  Absolute Peakfläche [µAU*s]
Untersuchungs-level (%) Summe der Nebenpeaks Hauptpeak
120  99104  15949990
 96153  15988085
 97723  15879248
110 89383  14567078
 87474  14592610
 88355  14558575
100  77587  13275901
 76162  13264078
 78209  13285496
90 65802  11513839
67811  11937356
68012  12037029
80 54208  10489899
55611  10594228
56819  10683872

und stellen die Linearität jetzt grafisch dar (wobei wir aus Vereinfachungsgründen anstatt der eigentlichen Konzentration in mg/mL des Produktes bzw. der Verunreinigungen das Untersuchungslevel in % angegeben haben):

Diese Abbildungen helfen uns, da wir jetzt die theoretischen absoluten Peakflächen mit Hilfe der jeweiligen Regressionsgerade (y = m* x + n) ausrechnen wollen. Natürlich können wir dafür in Excel auch die Formeln ACHSENABSCHNITT(Y_Werte;X_Werte) für den y-Achsenabschnitt (n) und STEIGUNG(Y_Werte;X_Werte) für die Steigung (m) verwenden. Damit haben wir folgende Parameter unserer beiden Regressionsgeraden:

  Steigung m
y-Achsenabschnitt n
RegressionsgeradeSumme der Nebenpeaks
1054,2 -28196
RegressionsgeradeHauptpeak 134429 -201743

Wenn wir jetzt in die Regressionsgerade y = m*x + n für x die Untersuchungslevel einsetzen (z.B. 1054,2 * 120- (-28196) = 154705), erhalten wir folgende Daten:

  Absolute Peakfläche [µAU*s]
Untersuchungs-level (%) Summe der Nebenpeaks Hauptpeak
 120  154705  16333217
 110  144162  14988928
 100  133620  13644638
 90  123078  12300349
 80  112535  10956059

Wir erinnern uns, dass wir für die Bestimmung der Genauigkeit gemessene Werte mit theoretischen Werten vergleichen müssen. Das können wir jetzt tun und die „Güte“ unserer Messwerte mit Hilfe der Wiederfindungsrate (recovery) bestimmen (= gemessener Wert / theoretischen Wert * 100%). Sie zeigt uns, wie nah unsere gemessenen Werte an den theoretischen Werten dran sind.

  Summe der Nebenpeaks     Hauptpeak
Untersuchungs-level (%)  Gemessener Wert Theoretischer Wert  Wiederfin-dungsrate [%]  Gemessener Wert Theoretischer Wert Wiederfin-dungsrate [%]
120  99104  154705 64  15949990 16333217 98
 96153 62  15988085 98
 97723 63  15879248 97
110  89383 144162 62  14567078 14988928 97
 87474 61  14592610 97
 88355 61  14558575 97
100  77587 133620 58  13275901 13644638 97
 76162 57  13264078 97
 78209 59  13285496 97
90  65802 123078 53  11513839 12300349 94
 67811 55  11937356 97
 68012 55  12037029 98
80  54208 112535 48  10489899  10956059 96
 55611 49  10594228 97
 56819 50  10683872 98

Bei Betrachtung der Wiederfindungsraten stellen wir fest, dass beim Hauptpeak alle gemessenen Werte zu fast 100% dem jeweiligen theoretischen Wert entsprechen. Super! Bei der Summe der Nebenpeaks ist dies leider nicht Fall, da hier der schon beim letzten Mal beobachtete Effekt der verschlechterten Detektion bei zunehmender Verdünnung (der ohnehin sehr geringen Mengen an Verunreinigungen) zu sehen ist.

Wenn dies wissenschaftlich vernünftig begründet werden kann, kann es im Rahmen einer Validierung durchaus ausreichend sein, für die Ermittlung der Genauigkeit nur die Wiederfindungsrate für den Hauptpeak basierend auf den absoluten Peakflächen zu bestimmen und zusätzlich für beide Parameter (Summe der Nebenpeaks und Hauptpeak) jeweils noch die Präzision mit Hilfe der relativen Peakflächen (wie bereits im letzten Blogartikel gezeigt).

Tags: Methodenvalidierung Lineare Regression Linearitaet Genauigkeit

Cookies erleichtern die Bereitstellung unserer Dienste. Mit der Nutzung unserer Dienste erklären Sie sich damit einverstanden, dass wir Cookies verwenden.
Weitere Informationen