Journal Club: Validierung eines Clot Lyse Assays als Wirksamkeitstest

Geschrieben von Anindya Ghosh Roy am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Einführung und Hintergrund

Rekombinanter menschlicher Gewebeplasminogenactivator (rtPA), die biotechnologisch hergestellte Version des Gewebeplasminogenaktivators (tPA), ist eine Serinprotease, die am Abbau von Blutgerinnseln beteiligt ist und zur Behandlung von Schlaganfällen verwendet wird. Als Enzym wandelt sie Plasminogen zu Plasmin um, welches wiederum unlösliches Fibrin zu löslichen Nebenprodukten abbaut. Dieser Prozess der Spaltung von Fibrin in lösliche Nebenprodukte wird als Fibrinolyse bezeichnet. Die Aktivität von rtPA wird üblicherweise durch Berechnen der Lyserate eines künstlich hergestellten Fibringerinnsels bestimmt. Eine Vielzahl kinetischer Wirksamkeitstests (potency assays) in Form halbautomatischer Lösungen oder auf Plattenbasis wurden bereits entwickelt. Im Falle eines Wirksamkeitstests für ein pharmazeutisches Produkt, das vom Qualitätskontrolllabor (QC) zur Freigabe für den Markt untersucht werden soll, muss die Methodik zuvor unter Einhaltung der ICH-Richtlinie Q2(R1) validiert worden sein.

Die ICH-Richtlinie erfordert für einen Wirksamkeitstest die Evaluierung der Parameter Spezifität, Genauigkeit, Präzision, Linearität und Arbeitsbereich. Dabei wird die Eignung auf zuvor definierte Werte überprüft. In diesem Artikel diskutieren wir die Validierung eines automatisierten „Gerinnselauflösungs“- (Clot Lysis) Aktivitätstests mit dem von Lichun Huang beschriebenen ACL TOP-Analyzer unter Bewertung der kritischen Parameter gemäß der ICH-Anforderungen. Dabei wurde die automatisierte Methode auch mit der bereits validierten manuellen und von den Behörden zugelassenen Methode verglichen.

 

Testprinzip und analytische Methode

Der Test basiert auf der Bildung eines künstlichen Fibringerinnsels durch Mischung von Fibrinogen, Plasminogen, Thrombin und tPA, welches anschließend aufgrund der Aktivität von tPA lysiert wird. Dies kann photometrisch gemessen werden: Eine zuvor trübe Lösung klart im Laufe der Zeit auf. Um die Wirksamkeit / Aktivität zu bestimmen, wird die Zeit verwendet, die erforderlich ist, um ein vorbestimmtes Niveau der Trübungsreduktion zu erreichen. Dabei ist die finale Lysezeit als 50 % Reduktion der Absorption definiert. Die Aktivität der Probe wird durch Vergleich mit einem parallel analysierten Referenzstandard unter Verwendung des in USP beschriebenen Ansatzes zur Analyse paralleler Linien (parallel-line assay; Anm. d. Red.: Wird im Ph. Eur Kapitel 5.3 auch als „the parallel-line model“ bezeichnet) berechnet. Beide Achsen (Lysezeit und tPA-Konzentration) wurden zuvor logarithmiert.

Der ACL TOP-Analyzer wurde aufgrund seiner Fähigkeit, programmiert werden zu können und aufgrund der Anwendung der Vorverdünnungsfunktion eingesetzt. Zusätzlich erlaubt er die Ablesung bei zwei verschiedenen Wellenlängen. Nach Analyse der Gerinnselauflösung bei 405 nm und 671 nm, wurde bei 405 nm eine bessere Absorption beobachtet und diese somit für die Messungen ausgewählt. Die Standardkurve wurde mit 5 verschiedenen Konzentrationen angesetzt, während die Proben, Kontrollen und Leerproben in den drei mittleren Verdünnungsstufen gemessen wurden. Standards, Kontrollen und Proben wurden mit Thrombin gemischt und die Reaktion wurde durch Zugabe einer zuvor gemischten Lösung aus Plasminogen und Fibrinogen gestartet. Für den Systemeignungstest wurden die für den manuellen Test definierten Kriterien verwendet. Sie sind definiert als:

  • Korrelationskoeffizient RStandard zwischen -0,995 und -1,0
  • Wert der Kontrolle (eine bekannte Probe): innerhalb des festgelegten Mittelwerts ± 15 %
  • Relative Standardabweichung RSDProbenreplikate und RSDKontrollenreplikate: ≤ 15 %

Diese Kriterien wurden mit den automatisierten Testergebnissen verglichen. Da die Ergebnisse der automatisierten Methode im Vergleich zur manuellen Methode eine höhere Genauigkeit aufwiesen, konnte der Kontrollbereich (obere und untere Kontrollgrenze) um ± 8 % eingegrenzt werden.

 

Analytische Methodenvalidierung und Diskussion

Für die analytische Methodenvalidierung wurde die Genauigkeit bestimmt, indem der Test 8 Mal von 3 verschiedenen Personen durchgeführt wurde (also insgesamt n = 24), wobei 5 verschiedene Konzentrationen (70 %, 85 %, 100 %, 115 % und 130 % der Zielaktivität) analysiert wurden. Die mittleren Wiederfindungswerte lagen in allen Fällen zwischen 98 % - 99 %, was dem vorgegebenen Akzeptanzkriterium von 95 % - 105 % entspricht.

Die Wiederholpräzision wurde unter Verwendung der Testkontrolle als Probe und Auswertung der Intra-Assay-RSD-Werte durchgeführt. Eine Person führte den Test dreimal mit jeweils 6 Probenpositionen im selben Gerät durch. Die erhaltenen RSD-Werte betrugen 1 %, 1 % und 2 %, was deutlich unter dem Akzeptanzkriterium von 5 % liegt. Für die Evaluierung der internen Laborpräzision wurde die Daten der Genauigkeitsexperimente hinsichtlich Assay-zu-Assay, Analytiker-zu-Analytiker, Tag-zu-Tag und Instrument-zu-Instrument ausgewertet. Alle ermittelten RSD-Werte lagen unterhalb der vordefinierten zulässigen Grenze von 5 %.

Für die Linearität wurde die Mittelwerte der gemessenen Aktivitäten (unter Verwendung der Daten der Genauigkeitsexperimente) gegen die erwarteten theoretischen Aktivitäten aufgetragen. Dabei konnte ein Korrelationskoeffizient von 0,997 erreicht werden. Steigung, y-Achsenabschnitt und die Restsumme der Fehlerquadrate (residual sum of quares, RSS) sowie eine Grafik sind im Paper gezeigt. Zusätzlich wurde die Linearität des Standards mit 5 Konzentrationen (5 mg/ml, 3,3 mg/ml, 2,2 mg/ml, 1,1 mg/ml und 0,99 mg/ml) untersucht. Dabei wurden nach logarithmischer Transformation der Lysezeit in Sekunden und der Konzentration in ng/ml Korrelationskoeffizienten zwischen -0,9997 und -1,0 erhalten. Frühere Experimente wiesen bereits einen breiten linearen Bereich von 400 ng/ml bis 10 μg/ml auf. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse der Genauigkeit, Präzision und Linearität konnte der Arbeitsbereich als 4,06 – 7,54 x 105 IU/mg bestimmt werden.

Die Spezifität wurde auf zwei Arten untersucht: erstens durch Analyse verschiedener kommerzieller Produkte (einschließlich Enzymen, Hormonen und Antikörpern) im Test und zweitens durch Spiking-Experimente zur Untersuchung ihres potentiellen Einflusses auf die Clot-Lyse-Aktivität. Die Idee hinter einem solchen Ansatz ist es, festzustellen, ob die Methodik durch Einsatz von anderen Substanzen unbeeinflusst bleibt. Beim ersten Ansatz wurde für alle Produkte keine Lyse beobachtet, mit Ausnahme eines eng verwandten Enzyms. Beim zweiten Ansatz konnten bei allen Proben Aktivitätswerte im mittleren Arbeitsbereich gemessen werden (entspricht ca. 100 % gewünschter Aktivität; auch wenn im Artikel keine Wiederfindungsraten erwähnt wurden), natürlich mit Ausnahme des eng verwandten Enzyms, wo ein additiver Effekt beobachtet wurde. Dennoch wurden die Spezifitätsparameter entsprechend der vordefinierten Akzeptanzkriterien als bestanden gewertet.

Darüber hinaus wurde die Stabilität der Probe unter Anwendung mehrerer Stressbedingungen (Hitze, Belichtung, hoher und niedriger pH-Wert sowie Oxidation) untersucht. Es wurde festgestellt, dass die Aktivität des Enzyms unterschiedlich war, wenn es bei 40°C für 4 und 7 Tage mit intensivem Licht behandelt oder einem pH-Wert von 4.0 unterzogen wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Methode stabilitätsindizierend ist, da sie Änderungen in der Aktivität detektieren kann.

Weiterhin war der Vergleich der zuvor validierten manuellen Methode mit der automatisierten Methode interessant. 44 Proben, einschließlich Wirkstoffen (drug substance), Fertigarzneimitteln (drug product), korrekt gelagerten sowie gestressten Proben, wurden verglichen. Alle Ergebnisse waren vergleichbar mit einer absoluten mittleren Differenz von nur 0,03 x 105 IU/mg. Die automatisierte Methode erwies sich jedoch als genauer und konnte somit Verluste der Aktivität (anhand der Stabilitätsproben erkennbar) schneller nachweisen.

 

Zusammenfassend ist die entwickelte automatisierte ACL TOP Methode vergleichbar mit der manuellen Methode. Zur Validierung wurde ein Bracketing-Ansatz für Genauigkeit, Linearität und Präzision angewendet. Alle ICH Q2(R1) Parameter für einen Wirksamkeitstest wurden erfolgreich mit sehr guten Ergebnissen evaluiert. Es wurde ein einziger Tippfehler in der Publikation beobachtet (im Methodenabschnitt zur Evaluierung der Linearität wird das Bestimmtheitsmaß R2 erwähnt, während in allen anderen Abschnitten der Korrelationskoeffizient R angeführt wird), was von untergeordneter Bedeutung ist. Diese Methode wurde später erfolgreich in die QC-Routineanalytik übertragen, da sie im Vergleich zum manuellen Assay eine bessere Präzision und Robustheit aufwies. Darüber hinaus sind die Misch- und Verdünnungsschritte dieses Tests kritisch, daher kann ein automatisches System im Allgemeinen robustere Ergebnisse garantieren.

Tags: Methodenvalidierung ICH Q2(R1) Wirksamkeit potency Bioassay

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