Ableitung der Richtigkeit aus der Linearität – Weg 2: Wiederfindung
Nachdem wir im letzten Blogbeitrag den ersten Lösungsweg (--> Normalisierung) für die Ermittlung der Richtigkeit bei Methodenvalidierungen, bei denen es keine Unreinheiten zum Spiken oder Alternativmethoden gibt, betrachtet haben, wollen wir uns heute den zweiten Lösungsweg ansehen.
Wir bleiben bei unserem Beispiel vom letzten Mal, wo eine SE-HPLC zur Bestimmung der Reinheit eingesetzt werden soll. Die Verunreinigungen werden als Summe der Nebenpeaks angegeben, während es sich bei dem Hauptpeak um unser gewünschtes Produkt handelt. Unser grundsätzlicher Ansatz besteht wie letztes Mal darin, die Richtigkeit aus der Linearität abzuleiten, da dies bei gegebener Spezifität (dies setzten wir wieder voraus) und Präzision entsprechend der Validierungsrichtlinie ICH Q2(R1) erlaubt ist.
Wir nehmen uns also den bereits bekannten Datensatz (5 Konzentrationen für die Linearität mit je drei unabhängig angesetzten Replikaten):
Absolute Peakfläche [µAU*s] | ||
Untersuchungs-level (%) | Summe der Nebenpeaks | Hauptpeak |
120 | 99104 | 15949990 |
96153 | 15988085 | |
97723 | 15879248 | |
110 | 89383 | 14567078 |
87474 | 14592610 | |
88355 | 14558575 | |
100 | 77587 | 13275901 |
76162 | 13264078 | |
78209 | 13285496 | |
90 | 65802 | 11513839 |
67811 | 11937356 | |
68012 | 12037029 | |
80 | 54208 | 10489899 |
55611 | 10594228 | |
56819 | 10683872 |
und stellen die Linearität jetzt grafisch dar (wobei wir aus Vereinfachungsgründen anstatt der eigentlichen Konzentration in mg/mL des Produktes bzw. der Verunreinigungen das Untersuchungslevel in % angegeben haben):
Diese Abbildungen helfen uns, da wir jetzt die theoretischen absoluten Peakflächen mit Hilfe der jeweiligen Regressionsgerade (y = m * x + n) ausrechnen wollen. Natürlich können wir dafür in Excel auch die Formeln ACHSENABSCHNITT(Y_Werte;X_Werte) für den y-Achsenabschnitt (n) und STEIGUNG(Y_Werte;X_Werte) für die Steigung (m) verwenden. Damit haben wir folgende Parameter unserer beiden Regressionsgeraden:
Steigung m |
y-Achsenabschnitt n |
|
RegressionsgeradeSumme der Nebenpeaks |
1054,2 | -28196 |
RegressionsgeradeHauptpeak | 134429 | -201743 |
Wenn wir jetzt in die Regressionsgerade y = m*x + n für x die Untersuchungslevel einsetzen (z.B. 1054,2 * 120 + (-28196) = 98312), erhalten wir folgende Daten:
Absolute Peakfläche [µAU*s] | ||
Untersuchungs-level (%) | Summe der Nebenpeaks | Hauptpeak |
120 | 98312 | 15929731 |
110 | 87770 | 14585442 |
100 | 77227 | 13241152 |
90 | 66685 | 11896863 |
80 | 56143 | 10552573 |
Wir erinnern uns, dass wir für die Bestimmung der Richtigkeit gemessene Werte mit theoretischen Werten vergleichen müssen. Das können wir jetzt tun und die „Güte“ unserer Messwerte mit Hilfe der Wiederfindungsrate (recovery) bestimmen (= gemessener Wert / theoretischen Wert * 100%). Sie zeigt uns, wie nah unsere gemessenen Werte an den theoretischen Werten dran sind.
Summe der Nebenpeaks | Hauptpeak | ||||||
Untersuchungs-level (%) | Gemessener Wert | Theoretischer Wert | Wiederfindungsrate [%] | Gemessener Wert | Theoretischer Wert | Wiederfindungsrate [%] | |
120 | 99104 | 98312 | 101 | 15949990 | 15929731 | 100 | |
96153 | 98 | 15988085 | 100 | ||||
97723 | 99 | 15879248 | 100 | ||||
110 | 89383 | 87770 | 102 | 14567078 | 14585442 | 100 | |
87474 | 100 | 14592610 | 100 | ||||
88355 | 101 | 14558575 | 100 | ||||
100 | 77587 | 77227 | 100 | 13275901 | 13241152 | 100 | |
76162 | 99 | 13264078 | 100 | ||||
78209 | 101 | 13285496 | 100 | ||||
90 | 65802 | 66685 | 99 | 11513839 | 11896863 | 97 | |
67811 | 102 | 11937356 | 100 | ||||
68012 | 102 | 12037029 | 101 | ||||
80 | 54208 | 56143 | 97 | 10489899 | 10552573 | 99 | |
55611 | 99 | 10594228 | 100 | ||||
56819 | 101 | 10683872 | 101 |
Bei Betrachtung der Wiederfindungsraten stellen wir fest, dass alle gemessenen Werte zu fast 100% dem jeweiligen theoretischen Wert entsprechen. Super!
Wenn dies wissenschaftlich vernünftig begründet werden kann, kann es im Rahmen einer Validierung durchaus ausreichend sein, für die Ermittlung der Richtigkeit nur die Wiederfindungsrate für den Hauptpeak basierend auf den absoluten Peakflächen zu bestimmen und zusätzlich für beide Parameter (Summe der Nebenpeaks und Hauptpeak) jeweils noch die Präzision mit Hilfe der relativen Peakflächen (wie bereits im letzten Blogartikel gezeigt).