Ableitung der Richtigkeit aus der Linearität – Weg 1: Normalisierung

Geschrieben von Dr. Janet Thode Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Im heutigen Blogbeitrag wollen wir uns einem durchaus öfter auftretenden Problem bei Methodenvalidierungen annehmen und an einem praktischen Beispiel aufzeigen, welche Lösungsmöglichkeiten es gibt.

Validiert werden soll eine SE-HPLC Methode, die zur Reinheitsbestimmung eines Arzneimittels eingesetzt werden soll. Es ist bekannt, dass Verunreinigungen (dabei handelt es sich z.B. um Aggregate und / oder Bruchstücke des Produktes) zu einem geringen Prozentsatz auftreten können.

Im Chromatogramm gibt es einen Hauptpeak, der dem intakten Produkt entspricht und ein paar kleinere Nebenpeaks, die den Verunreinigungen entsprechen und als Summe zusammengefasst werden. Betrachten wollen wir jetzt den Validierungsparameter Richtigkeit ("accuracy"). Leider kann man weder die Verunreinigungen separat erhalten und zum Spiken einsetzen, noch steht eine alternative unabhängige Bestimmungsmethode zur Verfügung. In diesem Fall erlaubt die Validierungsrichtlinie ICH Q2(R1) dann eine dritte Möglichkeit zur Bestimmung der Richtigkeit: „Accuracy may be inferred once precision, linearity and specificity have been established“ (4.1.1 c / 4.1.2 c).

Das klingt interessant. Nehmen wir also an, der Beweis der Spezifität wäre kein Problem, dann müssten wir also die Richtigkeit aus der Linearität ableiten können und prüfen, ob die Ergebnisse dabei auch noch präzise sind. Das klingt durchaus realisierbar.

Schauen wir uns dies an einem konkreten Beispiel an. Für die Bestimmung der Linearität waren 5 Konzentrationen geplant (Untersuchungslevel: 80%, 90%, 100%, 110%, 120% der Testkonzentration, die konkreten Konzentrationen lassen wir zur Vereinfachung weg). Da wir dabei die Richtigkeit ja gleich mit abdecken möchten, haben wir für jede dieser Konzentrationen 3 unabhängige Verdünnungen angesetzt. Nach Durchführung der Experimente haben wir diesen Datensatz hinsichtlich der absoluten Peakflächen erhalten:

  Absolute Peakfläche [µAU*s]
Untersuchungs-level (%) Summe der Nebenpeaks Hauptpeak
120  99104  15949990
 96153  15988085
 97723  15879248
110 89383  14567078
 87474  14592610
 88355  14558575
100  77587  13275901
 76162  13264078
 78209  13285496
90 65802  11513839
67811  11937356
68012  12037029
80 54208  10489899
55611  10594228
56819  10683872

Für die Bestimmung der Linearität wurden sowohl für die Summe der Nebenpeaks als auch für den Hauptpeak die Peakflächen gegen die tatsächlichen Konzentrationen aufgetragen und Regressionsgeraden mit jeweils einem Bestimmtheitsmaß von R2 > 0.99 erhalten (hier jetzt nicht gezeigt). Damit ist das vordefinierte Akzeptanzkriterium für die Linearität erfüllt und auf jeden Fall eine eindeutige Linearität gegeben. Somit können diese Daten dann auch für die Evaluierung der Richtigkeit herangezogen werden.

Bevor wir uns der Auswertung dieses Datensatzes zuwenden, sollten wir uns noch einmal vor Augen halten, was wir eigentlich zeigen wollen. Die Richtigkeit ist folgendermaßen definiert: „The accuracy of an analytical procedure expresses the closeness of agreement between the value which is accepted either as a conventional true value or an accepted reference value and the value found.“. Konkret heißt das, dass wir zeigen wollen, wie gut ein gemessener Wert dem tatsächlichen theoretischen Wert entspricht. Messwerte haben wir, aber wie ermitteln wie die tatsächlichen theoretischen Werte? Dafür gibt es verschiedene Ansätze – heute machen wir es mit einer Normalisierung und in einem folgenden Blogbeitrag werden wir einen anderen Weg aufzeigen.

 

Hm, wie geht das jetzt mit dem Normalisieren?

Durch das Normalisieren wollen wir alle erhaltenen Messwerte mit dem Wert für das Untersuchungslevel 100% vergleichen. Dafür wird der jeweilige Messwert mit 100 multipliziert und durch sein Untersuchungslevel dividiert (z.B. erster Nebenpeak-Wert: 100 * 99104 / 120 = 82587). Wir rechnen sie sozusagen alle auf 100% um. Damit sieht unser umgerechneter Datensatz dann so aus:

    Absolute Peakfläche [µAU*s]
Untersuchungs-level (%) Normalisiertes Level (%) Summe der Nebenpeaks Hauptpeak
(120) 100  82587  13291658
 80127  13323404
 81436  13232706
(110)  81257  13242798
 79521  13266009
 80322  13235068
(100)  77587  13275901
 76162  13264078
 78209 13285496
(90)  73114 12793154
 75345 13263729
75569  13374477
(80)  67759  13112373
 69513  13242785
 71024  13354840

Wir stellen beim Betrachten der Zahlen fest, dass zumindest die Zahlen des Hauptpeaks alle recht ähnlich sind und die der Summe des Nebenpeaks auch nicht so stark voneinander abweichen. Was aber heißt jetzt „nicht so stark“? Mathematisch können wir durch dies durch die relative Standardabweichung (RSD) ausdrücken. Dafür berechnen wir zunächst den Mittelwert und die Standardabweichung (SD) und teilen dann die Standardabweichung durch den Mittelwert und multiplizieren mit 100, wodurch wir das Ergebnis in Prozent haben.

Bei unserem Beispiel erhalten wir folgende Daten:

  Summe der Nebenpeaks Hauptpeak
Mittelwertabsolute Peakfläche [µAU*s]  76635 13237232
SDabsolute Peakfläche [µAU*s] 4581 136803
RSD [%]  6,0  1,0

Wie wir schon visuell an den Zahlen erkennen konnten, ist die relative Standardabweichung des Hauptpeaks mit 1% und die der Summe der Nebenpeaks mit 6% noch in sehr gutem bzw. absolut vertretbaren Rahmen. Wenn wir jetzt wieder an die Definition der Richtigkeit denken, was heißt das also? Es heißt, dass unsere gemessenen Werte, wenn wir sie auf 100% umrechnen, dem theoretischen Wert sehr gut entsprechen und damit unsere Messung wirklich recht richtig ist. Wir können also die relative Standardabweichung normalisierter Werte als Akzeptanzkriterium für die Bestimmung der Richtigkeit basierend auf den Linearitätsdaten heranziehen. Welche konkreten Grenzwerte als Akzeptanzkriterien zu wählen sind, kann nicht pauschal gesagt werden. Das beruht auf dem jeweils zulässigen Fehler und der maximal möglichen Richtigkeit der Methode. In unserem Beispiel jedoch wäre man mit einem Akzeptanzkriterium von RSD ≤ 10% für die Summe der Nebenpeaks und von RSD ≤ 2% für den Hauptpeak im grünen Bereich ;-)

 

Da war doch noch was… – wie sieht das mit der Präzision aus?

Ja, richtig, die ICH Q2(R1) gab dabei doch auch vor, dass die Präzision ebenfalls zu betrachten sei, siehe „Accuracy may be inferred once precision, linearity and specificity have been established“.

Dafür nehmen wir uns wieder unseren Datensatz, schauen uns dafür aber jetzt nicht die absoluten Peakflächen, sondern die relativen Peakflächen in area% an. Üblicherweise werden die bereits von der Software des Chromatografie-Systems mit ausgewertet und angeben. Alternativ könnte man sie sich natürlich auch selbst ausrechnen, in dem man für den jeweiligen Peak seinen Anteil an der Summe aller Peaks berechnet. In unserem Beispiel sieht das so aus:

  Relative Peakfläche [area%]
Untersuchungs-level (%) Summe der Nebenpeaks Hauptpeak
120  0,6175  99,3825
 0,5978  99,4022
 0,6116  99,3884
110  0,6099  99,3901
 0,5959  99,4041
 0,6032  99,3968
100  0,5810  99,4190
 0,5709  99,4291
 0,5852  99,4148
90  0,5683  99,4317
 0,5648  99,4352
 0,5618  99,4382
80  0,5141  99,4859
 0,5222  99,4778
 0,5290  99,4710

Theoretisch erwarten wir, dass wenn wir die Peakflächen zueinander ins Verhältnis setzen, diese unabhängig von der Verdünnung immer gleich sein sollten und damit lediglich den Schwankungen der Präzision ausgesetzt sind. Daher berechnen wir auch hier die relative Standardabweichung:

  Summe der Nebenpeaks Hauptpeak
Mittelwertrelative Peakfläche [area%]  0,5756 99,4244
SDrelative Peakfläche [area%]  0,0330  0,0330
RSD [%]  5,73  0,03

Wir stellen fest, dass obige These für den Hauptpeak auch durchaus zutrifft, für die Summe der Nebenpeaks jedoch durchaus ein Verdünnungseffekt zu beobachten ist (bei 120% liegt der Anteil im Durchschnitt bei 0,61 area%, bei 100% bei 0,58 area% und bei 80% nur noch bei 0,52 area%). Entsprechend ist die Präzision bei diesen sehr geringen Mengen auch nicht so toll wie die des vorherrschenden Hauptpeaks. Je nachdem, welche Akzeptanzkriterien gewählt wurden, kann dies jedoch noch absolut vertretbar sein.

 

Damit können wir zusammenfassend festhalten, dass wir bei gegebener Spezifität (das haben wir jetzt hier einfach mal vorausgesetzt) die Richtigkeit aus den Linearitätsdaten (absolute Peakflächen) durch Normalisierung auf 100% und Betrachtung der relativen Abweichung davon sowie durch Evaluierung der Präzision mit Hilfe der relativen Peakflächen ableiten können.