Verifizierung einer Arzneibuchmethode am Beispiel des LAL-Tests

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Für die Freigabe von Arzneimitteln ist nicht nur entscheidend, dass der Wirkstoff in angegebener Konzentration und Wirksamkeit vorhanden ist, sondern auch, dass das Arzneimittel möglichst wenig Verunreinigungen aufweist. Bei sterilen, z.B. parenteral verabreichten Arzneimitteln sollten nicht nur keine Keime mehr im Produkt vorhanden sein, sondern auch keine bakteriellen „Rückstände“. Darunter sind z.B. fieberauslösende Bestandteile der Zellmembran zu verstehen, sogenannte Endotoxine. Diese können mit verschiedenen Methoden nachgewiesen werden, eine davon ist der Limulus-Amöbozyten-Lysat (LAL) Test.

Die Durchführung dieses Tests ist in den Arzneibüchern beschrieben (Ph. Eur. 2.6.14 und USP <85>) und kann auf verschiedene Weise erfolgen, z.B. als quantitativer photometrischer Test oder als Limit-Test per Gel-Clot Technik. Bei einem quantitativen Test wird ein konkretes Ergebnis mit einem Zahlenwert erhalten, bei einem Limit-Test kann nur die Aussage getroffen werden, ob Endotoxine in einer Konzentration oberhalb eines Grenzwerts in der Probe vorhanden sind oder nicht.

Entsprechend gibt es für beide Tests (quantitativ oder Limit) unterschiedliche Anforderungen an die in der Methodenverifizierung zu evaluierenden Parameter:

Gel Clot Limit-Test

Quantitativer photometrischer Test (z.B. turbidimetrisch)

Bestimmung der MVD  
  Test auf interferierende Faktoren
 Bestimmung der deklarierten Lysatsensitivität Linearität
  Nachweisgrenze (LOD) *
  Robustheit *
  Wiederholpräzision (repeatability) *
* nicht explizit gefordert, aber ggf. durchaus sinnvolle zu evaluierende Parameter

Die Bestimmung der MVD (maximal valid dilution), also der größtmöglich erlaubten Verdünnung bei der der spezifizierte Endotoxinwert des Arzneimittels noch bestimmt werden kann, ist in beiden Fällen erforderlich. Die Formel zur Berechnung wird vom Arzneibuch vorgegeben und ist definiert als Produkt aus spezifiziertem Endotoxingrenzwert des zu analysierenden Arzneimittels und der Probenkonzentration geteilt durch deklarierte Sensitivität (bei der Gel Clot Technik) bzw. durch die niedrigste Standardkonzentration (bei photometrischer Bestimmung). Explizite Versuche sind nicht erforderlich, es handelt sich hier rein um die mathematische Berechnung. Natürlich ist die MVD jedoch bei der Planung der Experimente der anderen Verifizierungsparameter zu berücksichtigen. Die spätere Messung von Proben in der Routine erfolgt üblicherweise bei weniger starken Verdünnungen.

Auch die Vorgehensweise für den Test auf interferierende Faktoren wird vom Arzneibuch vorgegeben. Der Zweck des Tests ist der Nachweis, dass die Matrix des Arzneimittels die Wiederfindung eines zugesetzten Endotoxin-Spikes nicht beeinträchtigt. Oder anders gesagt, die Zusammensetzung des Arzneimittels an sich soll den Nachweis potentiell vorhandener Endotoxine nicht negativ beeinflussen. Dafür werden beim turbidimetrischen Test verschiedene Verdünnungen (alle weniger stark verdünnt als MVD) angesetzt, mit einer bekannten Endotoxin-Konzentration versetzt (= „gespickt“) und die Wiederfindungsrate des Spikes bestimmt. Auch bei der Gel Clot Methode werden Verdünnungen der Probe angesetzt und mit immer niedrigeren Endotoxin-Konzentrationen gespickt, wobei wie beim Test zur Bestimmung der deklarierten Lysatsensitivität vorzugehen ist. Entsprechend ist eine Probe auch frei von interferierenden Substanzen, wenn sie eine deklarierte Lysatsensitivität im gleichen Range wie die des Standards aufweist.

Die Bestimmung der deklarierten Lysatsensitivität findet nur bei der Gel Clot Technik Anwendung und kann vom Prinzip her ganz grob wie eine Linearitäts- und LOD-Bestimmung angesehen werden. Auch hier ist vom Arzneibuch genau vorgegeben, wie vorzugehen ist. Es ist eine Verdünnungsreihe des Endotoxin-Standards anzusetzen und der niedrigste Standard zu ermitteln, bei dem es noch zur Bildung eines Clots kommt. Mit vorgegebener Formel ist die Endpunkt-Konzentration zu berechnen, welche dann der deklarierten Lysatsensitivität entspricht, wenn sie im Bereich von 50 – 200% der Herstellerangabe liegt.

Eine Linearitätsbestimmung („assurance of criteria for the standard curve“) ist bei der quantitativen photometrischen Bestimmung vom Arzneibuch gefordert. So werden z.B. 4 Konzentrationen des Standards angesetzt, gemessen und die Auftragung der Logarithmen der Konzentration gegen die der Reaktionszeit mittels linearer Regression untersucht. Dabei muss der Korrelationskoeffizient der Regressionsgerade mindestens einen Wert von 0,980 aufweisen.

Die Bestimmung der Nachweisgrenze (LOD) ist kein geforderter Parameter, lässt sich aber leicht rechnerisch ermitteln, da es das Produkt aus geplanter Probenverdünnung (die Verdünnung, bei der die Probe in der Routine untersucht werden soll) und niedrigster Standardkonzentration der Linearitätsbestimmung ist.

Im Zuge der Robustheit können z.B. andere Chargen an Mikrotiterplatten oder Verdünnungspuffer getestet werden, sofern dies als sinnvoll erachtet wird. Diese werden dann wie oben beschrieben im Test auf interferierende Faktoren eingesetzt und gegen die bereits verwendeten verglichen. Auch die Ermittlung der Einstellung des optimalen pH-Werts könnte im Rahmen der Robustheit untersucht werden.

Eine Ermittlung der Wiederholpräzision kann in einigen Fällen durchaus sinnvoll sein, z.B. wenn diese wie im nächsten Abschnitt beschrieben zum System Suitability Test (SST) herangezogen werden sollen. Dies macht natürlich nur Sinn bei Proben, bei denen bekannt ist, dass sie noch geringe Endotoxin-Konzentrationen aufweisen, wie z.B. Proben während der Wirkstoffherstellung. Praktisch wird dafür dann üblicherweise von 6 Replikaten einer Probe die Endotoxin-Konzentration bestimmt und die relative Standardabweichung berechnet.

Zudem können SST Kriterien im Zuge der Verifizierung der Arzneibuchmethode definiert werden. Diese können z.B. bei der photometrischen Bestimmung neben dem Korrelationskoeffizienten für die Standardgerade die Negativ- oder Positivkontrolle umfassen oder Vorgaben zur relativen Standardabweichung der Replikate des Standards oder der Proben sein.

 

Fazit

Die Verifizierung einer Arzneibuchbuchmethode kann unterschiedlich umfangreich gestaltet werden. Erforderlich ist auf jeden Fall die Durchführung der im Arzneibuch vorgeschriebenen Tests. Bei einem relativ simplen Gel Clot Limit Test kann die Verifizierung sehr kurz gehalten werden. Dies ist natürlich auch bei einer quantitativen photometrischen Bestimmung möglich. Hier kann es aber in Abhängigkeit von der Probe oder von potentiellen Kundenanforderungen oder basierend auf der Erfahrung des Labors auch durchaus sinnvoll sein, weitere Parameter zu evaluieren.

 

Update 05.09.2019

Die FDA hat bei ihren vor Kurzem veröffentlichen Antworten auf Laborfragen hinsichtlich cGMP bekannt gegeben, dass die 1987 veröffentliche „Guideline on Validation of the Limulus Amebocyte Lysate Test as an End-Product Endotoxin Test for Human and Animal Parenteral Drugs, Biological Products, and Medical Devices“ zurückgezogen wurde, da sie den aktuellen Anforderungen der Behörde nicht mehr entspricht.

Tags: Arzneibuchmethoden Methodenverifizierung

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