HPLC: Was tun bei zu breiten Peaks?

Geschrieben von Eva Arnold Veröffentlicht in HPLC

HPLC-Methoden gehören vielfach zur Routineanalytik in pharmazeutischen QC-Laboren bei der Analyse von Arzneimitteln und deren Wirkstoffen unter GMP-Bedingungen.

Die Peakform eines HPLC-Chromatogramms ist äußerst kritisch für die Auswertung. Ändert sich die Form eines Peaks während einer quantitativen Messreihe einer Substanz, führt das zu verfälschten Ergebnissen mit der Folge, dass die gesamte Messreihe hinfällig wird. Daher sollte man stets ein wachsames Auge auf die Peakform haben.

Dies gelingt am besten, indem man in regelmäßigen Abständen das aktuelle Chromatogramm mit einem älteren Standardchromatogramm vergleicht. Sind die Peaks des aktuellen Chromatogramms deutlich verbreitert oder asymmetrisch, sollte unbedingt gehandelt werden.

Asymmetrische Peaks sind leicht daran zu erkennen, dass der Abstand vom Beginn des Peaks zur Peakspitze ein anderer ist als von der Peakspitze zum Ende des Peaks (siehe nebenstehende Abbildung). Die Klärung der Ursachen von asymmetrischen Peaks folgt demnächst in einem eigenen Blogbeitrag.

Weniger leicht erkennbar sind zu breite Peaks. Hier hilft ein Vergleich der Peakbreite mit älteren Chromatogrammen. Insbesondere bei neuen Methoden, zu denen man wenig Vergleichsmaterial wie alte Chromatogramme hat, ist die Identifizierung zu breiter Peaks äußerst schwer. Zunächst muss unterschieden werden, ob alle Peaks gleich breit wirken, oder einzelne Peaks deutlich breiter sind als andere.

 

Alle Peaks erscheinen recht breit – was nun?

Scheinen alle Peaks zu breit, kann das ganz „normale“ Ursachen haben. Sie können zum Beispiel aufgrund einer zu niedrigen Flussrate entstehen. Jede Säule hat abhängig von ihrem inneren Durchmesser (ID) eine ideale Flussrate, die in den Herstellerangaben verzeichnet ist. Säulen mit einem Durchmesser von 5 mm verwenden meist eine Flussrate von 1 mL/min, während 3 mm-Säulen bei etwa 0,3 mL/min ihre ideale Flussrate haben. Verwenden Sie die angegebene Flussrate oder wechseln Sie auf eine Säule mit einem kleineren ID.

Ein weiterer, oft vernachlässigter Punkt ist das Totvolumen des HPLC-Systems. Kombiniert man eine moderne, klein-dimensionierte Säule mit einem älteren HPLC-System, sollte man in Betracht ziehen, die Kapillaren ebenfalls auszutauschen. Insbesondere der Durchmesser der Kapillare zwischen der Säule und dem Detektor hat enormen Einfluss auf die Peakbreite – genauso wie ein alter Detektor mit einer zu großen Flusszelle (siehe nachfolgende Abbildung). Nicht nur die Flusszelle sondern auch die Parameter eines Detektors können einen Einfluss auf die Peakbreite haben. Setzen Sie die Datenaufnahmerate (meist in Hertz angegeben) höher und vergleichen Sie die Chromatogramme. Auch sollten Sie die Anlage auf Lecks untersuchen. Zwischen Säule und Detektor können selbst kleine Lecks fatale Folgen für die Qualität des Chromatogramms haben.

 

 

Die Peaks eines Chromatogramms können unterschiedliche Breiten aufweisen

Hat man ein Chromatogramm vorliegen, in dem einzelne Peaks breiter erscheinen als andere, kann das verschiedene Gründe haben. Während frühe Peaks mit kurzer Retentionszeit schmal erscheinen, können sehr späte Peaks mit langer Retentionszeit dagegen sehr breit sein. Das ist in den meisten Fällen normal. Dennoch sollte auf jeden Fall geklärt werden, ob sich hinter einem zu breiten Peak zwei schlecht getrennte Peaks verbergen. Bei UV/Vis-Detektion lohnt sich ein Blick auf das Absorptionsspektrum. Verändert sich dieses innerhalb eines Peaks, handelt es sich sehr sicher um zwei verschiedene Substanzen. Zur Trennung von zwei Peaks kann man zunächst versuchen den Gradienten zeitlich zu strecken oder eine anders dimensionierte Säule (z.B. kleinere Partikel, kleinerer ID) zu verwenden.

Im besten Fall haben Sie nun einen zu breiten Peak in zwei gut getrennte, schmale Peaks umwandeln können. Sollte dies nicht der Fall sein, haben Sie nach wie vor den zu breiten Peak vor sich. Bevor Sie nun alle Parameter ändern oder über die Anschaffung einer neuen Säule nachdenken, sprechen wir über mögliche Ursachen, die oft übersehen werden. Scheint der Peak oben abgeschnitten? Möglicherweise ist das Detektionslimit erreicht, der Detektor ist außerhalb des linearen Bereichs. Auch das Injektionsvolumen kann zu hoch sein und die Säule überfordern (besonders bei einem kleinen Säulen-ID). In beiden Fällen ist die Lösung ganz einfach: Verdünnen Sie die Probe bzw. verringern Sie das Injektionsvolumen. Auch der pH-Wert der mobilen Phase kann starken Einfluss auf die Peakbreite haben. Je nach der chemischen Eigenschaft einer Probe kann diese unterschiedlich ionisiert – also vollständig protoniert, deprotoniert oder neutral – vorliegen. In den meisten Fällen gilt als Faustregel: Der pH-Wert der mobilen Phase sollte nie dem pKS-Wert der Substanz gleichen.

Ist weder ein versteckter Doppelpeak noch ein falscher pH-Wert der mobilen Phase die Ursache eines frühen, breiten Peaks, mangelt es hier an der Fokussierung. In diesem Fall sollte eine Anpassung des Gradienten die Lösung des Problems sein. Ein klassischer Fehler bei der Umkehrphasen-HPLC beispielsweise ist ein von Beginn an zu hoher Anteil organischen Lösungsmittels (z.B. um Zeit zu sparen). Relativ polare Substanzen werden so von Beginn an mitgeschleppt und werden so als breite Peaks niedriger Retentionszeit detektiert. Startet man mit 100% Wasser, bleiben diese Substanzen zunächst an der Säule hängen und lassen sich durch steigenden Lösungsmittelgehalt fokussiert eluieren.

 

Mit der Zeit breiter werdende Peaks und ihre Ursachen

Verändert sich die Breite der Peaks im Laufe der Zeit, liegen andere Gründe vor als im oberen Abschnitt besprochen. Hier heißt es zunächst: Vorsäule wechseln, gegebenenfalls Laufmittel erneuern. Führt das zu keiner Besserung, kann eine Spülung der Säule von Vorteil sein – gegebenenfalls sogar eine Rückspülung, indem die Säule umgekehrt angeschlossen und von hinten nach vorne gespült wird. Eine Rückspülung sollte in jedem Fall vorher mit den Herstellerangaben abgeglichen werden, da nicht alle Säulen für eine Rückspülung geeignet sind! Es bietet sich an, bei längeren Spülvorgängen den Detektor abzukoppeln, um eine Folgekontamination zu vermeiden.

Auch verdreckte Inline-Filter, Fritten, Kapillaren oder Injektoren (Autosampler) können das Problem sein. Wer ein zweites HPLC-System zur Verfügung hat, kann zur Erleichterung der Diagnose die HPLC-Säule im zweiten System anschließen. Ist hier das Chromatogramm normal, liegt das Problem nicht (mehr) bei der Säule und das erste HPLC-System muss ausgiebig gespült und auf Lecks untersucht werden.

Zeigt die Säule auch bei anderen HPLC-Systemen zu breite Peaks und kann eine Kontamination des HPLC-Systems ausgeschlossen werden, muss die HPLC-Säule ersetzt werden. Je nach Alter und Probenanzahl bzw. -typ ist auch das ganz normal. Sollte der Säulenverschleiß höher als üblich sein, kann dies an einer falschen / fehlenden Probenvorbereitung oder unpassend gewählten Methodenparametern liegen. Eine zu hohe Flussrate, zu hohe Temperaturen, zu starke Lösungsmittel oder auch ein zu hoher oder niedriger pH-Wert können die Säulenalterung beschleunigen. Halten Sie sich stets an die Herstellerangaben.

Da Fehlersuche bei der HPLC sehr zeitaufwendig ist, hoffen wir, mit diesem Blogbeitrag Hilfestellung geben zu können und Lösungsideen aufgezeigt zu haben.