Die HPLC-Anlage: einfach erklärt

Geschrieben von Eva Arnold am . Veröffentlicht in HPLC

Nicht nur in Universitätslaboren, sondern insbesondere in den Laboren der pharmazeutischen Industrie oder Auftragslaboren spielen HPLC-Methoden eine wichtige Rolle, wie beispielsweise bei Reinheitsbestimmungen von Arzneimitteln und ihren Wirkstoffen im Rahmen der Qualitätskontrolle. Daher wollen wir uns die HPLC-Anlage einmal genauer ansehen.

Mit Hilfe der Hochdruckflüssigkeitschromatographie (High pressure liquid chromatography, HPLC) ist man in der Lage, in Lösung befindliche Stoffe chromatographisch aufzutrennen. Man kann sich eine HPLC-Anlage wie einen stetigen Fluss vorstellen:

Angetrieben von der Pumpe werden separate Laufmittel aus Vorratsbehältern (A) in eine gemeinsame Mischkammer (B) transportiert. Hierbei wird über Ventile das Mischungsverhältnis der Laufmittel festgelegt. Ausgehend von der Mischkammer begibt sich das Laufmittelgemisch zum Injektor (C), dieser kann vollautomatisiert (Autosampler) oder manuell funktionieren (manuelles Injektionsventil). Über eine separate Kapillare, der sogenannten Probenschleife, führt der Injektor über ein Ventil die zu analysierende Probe zu, welche vom Laufmittelstrom mitgerissen wird. Das Laufmittel samt Probe fließt nun weiter und trifft auf die HPLC-Säule (D).

Der Inhalt der Säule besteht aus eng gepackten Partikeln, die je nach Säulentyp mit unterschiedlichen Endgruppen ausgestattet sind. Während des Transports durch die Säule interagieren die Probenbestandteile unterschiedlich stark mit den Endgruppen und halten mehr oder weniger stark daran fest. Das bekannteste Säulenmaterial ist die Umkehrphase, im Englischen reversed phase oder kurz RP. Sie besteht aus Kieselgel-Partikeln, die mit langen Kohlenwasserstoffketten (C8 oder 18) ausgestattet sind. Aufgrund der Kohlenwasserstoffketten hat dieses Säulenmaterial einen unpolaren Charakter. Sehr unpolare Probenbestandteile gehen daher starke Wechselwirkungen mit dem Säulenmaterial ein und bleiben zunächst dort hängen, während sehr polare Bestandteile weitestgehend unbeeinträchtigt durch die Säule passieren und mit dem Laufmittel mitgeschwemmt werden.

In der Mischkammer (B) kann nun das Verhältnis der Lösungsmittel geändert werden, so dass die an die Säule gebundenen Probenbestandteile nach und nach mitgeschwemmt werden. In der Regel geschieht dies durch einen linearen Gradienten zwischen zwei Laufmitteln. In unserem Beispiel ändern wir das Verhältnis der Laufmittel von polar (z.B. Wasser, hellblau) zu unpolar (z.B. Acetonitril, hellrot). Je unpolarer das Laufmittelgemisch wird, desto eher werden die unpolaren Probenbestandteile von den Säulenpartikeln gelöst: zuerst die schwach bindenden, zuletzt die stark bindenden. 

Der stete Laufmittelstrom passiert anschließend den Detektor (E), der die verschiedenen gelösten Probenbestandteile detektiert. Je nach Anwendung gibt es eine Vielzahl verschiedener Detektoren. Der einfachste wäre ein UV/Vis-Detektor, der die Absorption der Probenbestandteile bei einer eingegebenen Wellenlänge misst. Die Messung wird mithilfe eines Computerprogramms (F) graphisch dargestellt und man erhält ein Chromatogramm, bei dem im besten Fall ein einzelner Probenbestandteil einen Absorptionspeak verursacht. Im Chromatogramm kann man nun die Retentionszeit, also die Zeit von der Injektion bis zur Detektion, des jeweiligen Peaks ablesen. In unserem Beispiel hätten polare Bestandteile (blau) eine deutlich geringere Retentionszeit als unpolare (rot). Wenn man weiß, welche Substanzen in der Probe vorhanden sind, kann man die Peaks mithilfe von Standardsubstanzen identifizieren, indem man die Retentionszeiten und Absorptionsspektren untereinander vergleicht. Unbekannte Substanzen zu identifizieren ist weitaus komplexer. Hier benötigt man nachgeschaltete Analytikmethoden, um beispielsweise die Masse (Massenspektrometer) oder Struktur (Kernspinresonanz, NMR) herauszufinden. Hierfür kann man einzelne HPLC-Fraktionen auffangen (Fraktionssammler) und nachträglich weiter analysieren. Sehr beliebt ist aber auch eine direkte Kopplung des Massenspektrometers an die HPLC-Anlage (LC-MS Kopplung, wie in diesem Beispiel), wodurch die chromatographisch getrennten Probensubstanzen ohne Umwege auf ihre Masse hin untersucht werden können. Nach erfolgter Detektion wandert der Laufmittelfluss in einen geeigneten Abfallkanister (G).

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Tags: HPLC, Hochdruckflüssigkeitschromatographie

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