Erhöhung der Sensitivität bei LOD/LOQ-Problemen bei HPLC-Methoden

Geschrieben von Eva Arnold am . Veröffentlicht in HPLC

Bei der Validierung von Methoden zur Reinheitsprüfung von Arzneimitteln oder ihren Wirkstoffen kommt man früher oder später an den Punkt, an dem man die Nachweis- und Bestimmungsgrenze bestimmen muss. Die Nachweisgrenze, auf Englisch Limit of detection oder LOD, ist definiert als die niedrigste Menge des Analyten einer Probe, die noch detektiert werden kann. Hier geht es nur um die Detektion, nicht die Quantifizierung – während es bei der Bestimmungsgrenze (englisch: Limit of quantitation, LOQ) um die niedrigste Menge des Analyten einer Probe geht, die noch zuverlässig quantifiziert werden kann. Das heißt, die Quantifizierung muss den gegebenen Anforderungen hinsichtlich Präzision und Richtigkeit entsprechen.

 

LOD und LOQ bei HLPC-Methoden

Bei chromatographischen Methoden wie der HPLC (high performance liquid chromatography) bestimmt man diese Grenzen üblicherweise mittels des Signal-Rausch-Verhältnisses (englisch: Signal-to-noise ratio; S/N). Die Voraussetzung hierfür ist das Vorhandensein einer Basislinie mit Basislinienrauschen. Die Höhe dieses Basislinienrauschens ergibt sich aus der halbierten Differenz der unteren und oberen Tangente der Basislinie. Bei einer waagerecht verlaufenden Basislinie entspricht dies der halben Differenz zwischen dem höchsten und niedrigsten gemessenen Signal der Basislinie (siehe Abbildung oben). Vorsicht ist geboten bei kontinuierlich ansteigenden oder absteigenden Basislinien, wie sie bei Gradientenläufen oft vorkommen. Hier ist es besonders wichtig, die Tangenten dem wahren Verlauf der Basislinie anzupassen (siehe Abbildung unten: grüne Linien), um nicht einen verfälscht hohen Wert als Basisrauschen zu deklarieren (siehe Abbildung unten: rote Linien). Anschließend setzt man die Höhe des Analyten-Peaks, gemessen von der Mitte des Basislinienrauschens aus, in Relation zur Rauschhöhe.

Laut dem ICH Q2(R1), dem harmonisierten Leitfaden zur Methodenvalidierung, wird zur Bestimmung des LODs mindestens ein Signal-Rausch-Verhältnis von 2:1 benötigt, üblich ist eigentlich eher 3:1. Einfach gesagt: Ist ein Peak doppelt / dreimal so hoch wie das Basislinienrauschen, ist er in den meisten Fällen gut als Peak zu identifizieren. Strenger ist es bei dem LOQ: Hier wird ein Verhältnis von mindestens 10:1 als akzeptabler Wert vorgeschlagen, um den Analyten verlässlich quantifizieren zu können.

 

Lösungsansätze bei „unveränderbaren“ Methoden

Gerade bei Reinheitsprüfungen ergibt sich hieraus ein Problem: Um die Reinheit eines Produkts zu untersuchen, möchte man möglichst niedrige Konzentrationen des Analyten und insbesondere möglicher Verunreinigungen zuverlässig quantifizieren können. Dies kann bedeuten, dass selbst robuste Routinemethoden, die eine zuverlässige Spezifität und Richtigkeit bei den üblichen Arbeitskonzentrationen liefern, bei niedrigen Analyt-Konzentrationen hinsichtlich des LOQ scheitern können. Steht man nun vor dem Problem, die Methode nicht mehr verändern zu dürfen, da sie z.B. bereits so bei der Behörde eingereicht wurde, so gibt es dennoch ein paar Lösungsansätze. Zur Fehlersuche sollte an dieser Stelle, soweit möglich, auf ältere Chromatogramme zurückgegriffen werden. Zeigen diese ein geringeres Rauschen, kann man sich auf die Veränderungen fokussieren, die zum erhöhten Rauschen geführt haben könnten. Zunächst einmal sollte eine Verunreinigung der verwendeten Eluenten untersucht werden. Bereits der Wechsel des Eluentenherstellers kann zu einer deutlichen Veränderung des Basislinienrauschens führen. Bei wässrigen mobilen Phasen sollte grundsätzlich eine Filtration erfolgen. Sind die verwendeten Filter noch in Ordnung? Wurde vielleicht auch hier der Hersteller gewechselt? Auch die Entgasung der Eluenten sollte stets überprüft werden.

Als nächstes sollte man die Trennsäule samt Vorsäule unter die Lupe nehmen. Schon geringe Verunreinigungen können das Basislinienrauschen stark erhöhen. Also am besten zunächst eine neue Vorsäule einsetzen und gegebenenfalls eine neue Trennsäule hinzuziehen und die Chromatogramme untereinander vergleichen. Ist das Rauschen gleich, kann der Faktor „Säule“ erst einmal außen vor gelassen werden. Ein weiterer Faktor könnte nun die HPLC-Anlage sein: Versteckt sich eine Verunreinigung oder Luft im System? Eine regelmäßige Reinigung und Wartung der Anlage ist eine Grundvoraussetzung zur guten HPLC-Analytik.

Gibt es bei Eluenten und der Anlagen-Hardware nichts zu beanstanden, kann die Ursache des Rauschens in der Natur der verwendeten Methode liegen. Soll diese Methode und die Konzentration des Analyten unverändert bleiben, gibt es nur einen möglichen Lösungsansatz: Die Subtraktion der Basislinie einer Blank-Probe von der Analyt-Probe. Wenn dies nicht bereits so in der Validierung durchgeführt wurde, so ist dies als Änderung aufzufassen und muss, je nachdem wie detailliert das Dossier geschrieben ist, der Behörde mitgeteilt werden. Angesichts der aktuellen Diskussionen über Datenintegrität ist dieser Ansatz möglicherweise nicht die erste Wahl und etwas fragwürdig.

 

Lösungsansätze bei noch änderbaren Methoden

Sind noch Änderungen an der Methode vertretbar (weil man sich z.B. gerade in „Familarization Trials“ während eines Methodentransfers befindet), gibt es noch weitere Lösungsansätze, um das Basislinienrauschen zu minimieren und damit das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen. In vielen Fällen ist der verwendete Lösungsmitteltyp des Eluenten verantwortlich für das Rauschen in der Basislinie. Erfolgt die Detektion des Analyten durch Absorptionsmessung, fällt dies insbesondere bei niedrigen Detektionswellenlängen um die 200 nm ins Gewicht. Zunächst sollte also geprüft werden, ob die Detektion auch bei höheren Wellenlängen zuverlässig durchgeführt werden kann. Viele Substanzen zeigen beispielsweise bei 254 nm ein (weiteres) Absorptionsmaximum. Ist die Änderung der Detektionswellenlänge oder -methode keine Option, lohnt sich ein Blick auf die Eluentenauswahl: Methanol zeigt bei niedrigen Wellenlängen eine höhere Eigenabsorption, die kleinere Analytenpeaks „verschlucken“ kann. Auch wenn es mit mehr Aufwand verbunden ist, kann sich der Austausch von Methanol gegen Acetonitril hier als lohnenswert erweisen.

Die Wahl der Trennsäule kann sich ebenfalls auf das Rauschen auswirken. Als Faustregel gilt: Je kleiner die Dimensionen (insbesondere der Durchmesser) einer Säule, desto höher erscheinen die Peaks. Dies gilt auch für die gesamte HPLC-Anlage und die verwendeten Kapillaren (siehe auch unseren Blogbeitrag zu zu breiten Peaks). Da alle Peaks durch kleinere Säulen-/Anlagen-Dimensionen in ihrer Höhe verstärkt werden, kann hierdurch aber auch stärkeres Rauschen verursacht werden. Selbstverständlich hängt die Peakhöhe noch von weiteren Faktoren ab, wie zum Beispiel der Wahl der richtigen Fließgeschwindigkeit. Eine zu hohe Flussrate bei einer zu niedrigen Detektionsfrequenz kann zu Verlusten bei der Detektion führen, weil der Detektor schlichtweg nicht ausreichend „Zeit“ hat, den Analyten vernünftig zu detektieren. Auch verschiedene Säulenmatrices können die Sensitivität beeinflussen. Zur Wahl der passenden Säule kann man keine pauschale Aussage treffen. Hier hilft es, sich von verschiedenen Herstellern beraten zu lassen und Probeexemplare verschiedener Trennsäulen auszuprobieren.

Tags: HPLC, LOD Methodenvalidierung ICH Q2(R1)

Cookies erleichtern die Bereitstellung unserer Dienste. Mit der Nutzung unserer Dienste erklären Sie sich damit einverstanden, dass wir Cookies verwenden.
Weitere Informationen